《分子標記SSR標記》PPT課件

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1、SSR標記一、簡介、原理二、多態(tài)性基礎三、開發(fā)、前景主講人：高慧一、SSR標記原理簡單序列重復(singlesequencerepeat）簡稱SSRs)或微衛(wèi)星(microsatellite)序列大量地存在于大多數(shù)真核生物及部分原核生物基因組的非編碼區(qū)和編碼區(qū)中，由串聯(lián)的1-6個核苷酸重復片段構成，長度一般在100bp以下，具有長度的超變性。原理:與微衛(wèi)星序列相鄰的兩側區(qū)域保守性通常較高，可以在此保守區(qū)域設計一對特異的PCR引物，擴增其中的微衛(wèi)星序列，通過聚內(nèi)酞胺凝膠電泳，即可顯示出個體間在此位點的微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。二、SSR標記多態(tài)性基礎

2、目前研究過的所有植物中均存在著SSR多態(tài)性。絕大多數(shù)作物，如大豆、水稻、小麥、玉米、大麥等中，SSR位點上的等位基因數(shù)目可多達十幾個乃至幾十個，個別作物多態(tài)性水平較低。和其他DNA分子標記相比，單個SSR位點檢測到的等位基因個數(shù)和多態(tài)性指數(shù)(diversityindex，用1-E可表示，其中P為某一位點第i個等位基因)是最高的。對人類SSR的研究表明，核心序列的重復次數(shù)與SSR的長度多態(tài)性有密切關系。重復次數(shù)增加，SSR的長度多態(tài)性增高。這一趨勢也在一些作物中得到證實。不同重復類型SSR多態(tài)性水平存在差異，二核苷酸重復構成的SSR多態(tài)性水平要

3、高于其他類型。同一類型SSR的不同位之間，其多態(tài)性水平也不一樣。有些種類SSR位點其多態(tài)性水平明顯高于其它位點.如在大豆的研究中發(fā)現(xiàn)7個(ATT)n位點等位基因數(shù)目可多達11-26個;由AT重復構成的SSR甚至可區(qū)分遺傳基礎極其狹窄的日本梗稻育成品種。(TAA/ATT)n類型SSR是小麥基因組中最豐富、多態(tài)性最高的三核苷酸重復類型SSR。但因(AT)n類型寡聚核苷酸探針容易形成二級結構，降低了篩選效率，影響了這一類型SSR的分離.然而現(xiàn)有研究表明，(AT)n類型SSR仍是可以分離的。SSR標記的優(yōu)勢與其他分了標記如:如RAPD,RFLP等相比

4、，SSR標記具有以下的優(yōu)點:（1）在植物基因組中大量地、隨機地分布，具有廣泛的位點變異，揭示比RAPD,RFLP更多的多態(tài)性.（2）SSR標記揭示的是單個位點上復等位基因的信息，為共顯性標記，能夠區(qū)分純合型和雜合型，提供完整的遺傳信息.（3）微衛(wèi)星序列多態(tài)性可以用PCR方法檢測，不需要過多的分了克隆乎段，對DNA模板的要求不高，重復性好.因此成為在植物中日前運用最廣泛的分了標記之一，廣泛地運用于植物種質(zhì)鑒定、分了標記連鎖圖的構建和群體遺傳學等諸多領域.但是微衛(wèi)星標記存在一個重要的局限性就是微衛(wèi)星序列兩側區(qū)域在種間保守性往往較低.種間擴增微衛(wèi)星

5、標記僅僅局限于同一個屬或相近的屬的不同物種間的擴增，這大大限制了SSR標記在其他物種中的運用現(xiàn)在有一些從微衛(wèi)星序列衍生而來的其他分了標記，不用分離單個微衛(wèi)星位點而獲得多個位點指紋圖譜，如LSSRs、、SAM等，但由于多位點微衛(wèi)星指紋圖譜帶型復雜，難以確定等位基因，大多為顯性標記，這限制了它們的運用的范圍三、SSR標記的開發(fā)傳統(tǒng)用于克隆單位點微衛(wèi)星序列的方法包括以下步驟:(1)構建小片段或大片段的基因組.(2)篩選陽性克隆.通過傳統(tǒng)的影印或挑單菌落點膜的方法，把克隆轉移到尼龍膜上，經(jīng)過固定后，用標記過的序列重復寡核有酸或含微衛(wèi)星序列的探針‘與尼

6、龍膜上的克隆點雜交，篩選出其中的陽性克隆.(3)測序、設計引物、優(yōu)化PCR反應條件.獲得的陽性克隆經(jīng)過確認后，全部或經(jīng)過隨機挑選后測序，然后根據(jù)微衛(wèi)星序列兩側保守區(qū)域的序列設計引物，優(yōu)化PCR擴增的條件，獲得穩(wěn)定、可靠的SSR標記。微衛(wèi)星標記分離技術為了避免篩選文庫，現(xiàn)在有一些與其他成熟技術結合的分離微衛(wèi)星標記的方法，包括:（1）運用RAMP和RAPD技術分離單位點微衛(wèi)星標記RAMP利用5’含有四個錨定堿基的微衛(wèi)星引物結合不同的RAPD引物在基因組DNA中擴增，獲得片段包括兩頭帶反向微衛(wèi)星序列的擴增片段(為USSR產(chǎn)物)、隨機擴增的片段(RA

7、P產(chǎn)物)、隨機引物與微衛(wèi)星基因座間的片段(SSR產(chǎn)物).用標記的5‘錨定引物擴增或經(jīng)Southern后在用標記的微衛(wèi)星探針與之雜交后，再經(jīng)過自顯影，可以得到只含微衛(wèi)星標記的指紋圖譜.在RAMP和RAPD技術的基礎上，人們運用RAMP技術和RAPD技術擴增基因組DNA，得到擴增產(chǎn)物，然后用標記的微衛(wèi)星的探針與PCR產(chǎn)物Southern雜交或用標記微衛(wèi)星錨定引物，在PCR擴增后膠上直接觀測，選擇陽性條帶克隆}22i、或者首先克隆所有的PCR產(chǎn)物，制成微列陣，然后篩選克隆。(2)利用1SSR技術分離單基因座微衛(wèi)星序列1SSR是1994報道的一種方法

8、.這種方法是用3’或5’端帶有1一4個錨定堿基的微衛(wèi)星引物，來擴增基因組獲得在兩端帶有相反排列的微衛(wèi)星序列的DNA片段，經(jīng)電泳后，顯示復雜的指紋圖譜.用1SSR引物