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《利用轉(zhuǎn)基因畢赤酵母高表達(dá)重組人胰島素》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文利用轉(zhuǎn)基因畢赤酵母高表達(dá)重組人胰島素姓名：李軍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化工指導(dǎo)教師：陳勁春2003.5.10利用轉(zhuǎn)基因畢赤酵母高表達(dá)重組人胰島素摘要胰島素是治療I型糖尿病的必需藥物，具有巨大的市場(chǎng)需求。畢赤酵母是一種可以以甲醇為唯一碳源的非常規(guī)酵母，近年來，發(fā)展成為蛋白高效表達(dá)體系。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)人胰島素前體的畢赤酵母菌株，發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素具有重要意義。論文中，選用巴斯德畢赤酵母GSl15菌株為受體菌，分泌型質(zhì)粒pPIC9k為載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9k／HIP，經(jīng)線性化后，電擊法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母。篩
2、選出his+Muf表型陽性克隆86株，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用重組菌對(duì)G418抗性的差異篩選出了具有不同外源基因拷貝數(shù)的菌株，并成功表達(dá)了人胰島素前體，而且各菌株的誘導(dǎo)表達(dá)水平與其拷貝數(shù)成正相關(guān)。獲得了5—7個(gè)拷貝數(shù)的工程菌兩株，，其誘導(dǎo)表達(dá)水平最高。／進(jìn)一步研究了其表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間t的延長(zhǎng)，重組人胰島素前體表達(dá)量也隨之增加，72小時(shí)達(dá)高峰。在400mLBMGY培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵液經(jīng)分離純化以及蛋白質(zhì)的加工獲得了少量人胰島素樣品。利用免疫酶標(biāo)法，10uL樣品測(cè)得活性126．4uIU，證明具備人胰島素活性。結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的人胰島素前
3、體基因在畢赤酵母中獲得了正確的表達(dá)，表達(dá)的人胰島素前體可以被正確的加工和折疊。這為進(jìn)。步＼研究重組菌的發(fā)酵和表達(dá)創(chuàng)造了條件。^夕～關(guān)鍵詞：人胰島素前修巴斯德畢赤酵母，基因重組夕高拷黟生物活性、7HIGHEXPRESSl0N0FRECOMBINANTHUMANINSULINBYTRANSGENICYEASTP，(刪B4SZ移尺巧ABSTRACTHumaninsulinisanindispensablemedicineforpatientswithIDDM(insulin—dependentdiabetesmellitus)inspiteofther
4、eareseveralcompoundswithsomebloodsugar-loweringeffect．Therefore，highexpressionoftherecombinanthumaninsulinisagreattarget，whichhasattractedmoreandmoreattentionfromtheresearchersaroundtheworldThemethylotrophicyeastPichiapastorisisarecentlydevelopedsystemforexpressingheterologou
5、sproteins．Ourpurposeistohighlyexpressthehumaninsulinbythissystem．Firstly,weselectedthesecretingplasmidpPIC9kasvectortoconstructrecombinantplasmidpPIC9k／HIPandyeastPichiapastorisGS15asthegene—expressionhost．Afterphysicalmappingandthenucleotidesequencingofthepurposegene，thereco
6、mbinantplasmidpPIC9k／HIPwaslineamizedbyrestrictionendonucleaseBglIIandtransformedintothehostGS15byelectroporation．TheG418(geneticin)resistancewasusedforscreeninghigh—copytransformantsfromthegainedhis+Muffphenotype86transformants．AfterfermentationOfthechosenstrains，thefermenta
7、tionsupernatewasdeterminedbyTricine。SDS-PAGE，whichindicat．edthetransgenicyeaststrainscouldhi曲lyexpressandsecretetheHIP．Moreover,itprovedthattheexpressionlevelincreasedwiththeincreasinggenecopyinrecombinantsTheexpressionquantityofonehigh—copystrainindicatedtheexpressingpro—ins
8、ulinincreasedwithtimecourseandreachedthemaximumexpressionafter72hour
