骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘生脂肪細(xì)胞及祛脂素去脂化作用的研究

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1、Y935609骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞i秀生脂肪細(xì)胞及祛脂素去睛化作用的研究計(jì)：學(xué)位論文：36頁表格：6個(gè)插圖：8幅魏志杰指導(dǎo)教師：宋振嵐教授申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士學(xué)位專業(yè)名稱：內(nèi)科學(xué)論文提交日期：2006年6月論文答辯日期：2006年6月學(xué)位授予單位：大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)位授予時(shí)間：2006年6月評(píng)閱人答辯委員會(huì)主席獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得大連醫(yī)科大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我

2、一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：重魁查查，簽字日期：碰年量月上日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者及指導(dǎo)教師完全了解大連醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意大連醫(yī)科大學(xué)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)大連醫(yī)科大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。簽字日期：≯卯丘年』月上日骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘生脂肪細(xì)胞及祛腿素去脂化作用的研究碩士研究生：魏志杰指導(dǎo)教師：

3、宋振嵐教授專業(yè)名稱：內(nèi)科學(xué)摘要目的：通過體外分離和濃聚成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，并研究祛脂素對(duì)此誘導(dǎo)分化過程的影響，進(jìn)一步研究觀察祛脂素在再生障礙性貧血的去脂化作用，為治療再生障礙性貧血開辟一條新途徑。方法：1．取未累及骨髓的住院患者30例，中位年齡為53．6歲，再生障礙性貧血(AA)患者12例，中位年齡為56．4歲。常規(guī)抽取肝素抗凝骨髓液，收集單個(gè)核細(xì)胞層，按1x106cells／cm2密度接種于培養(yǎng)瓶孵育，5天后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞，3~4天換液1次。實(shí)驗(yàn)組：分別將傳至第1、3、5代的貼壁細(xì)胞按2×105／ml接種

4、于6孔板，370C，5％C02，飽和濕度下孵育，24h后更換培養(yǎng)體系為含有終濃度為1岬ol，L地塞米松、O．5mmol／L的IBMx、10“∥ml牛胰島素、100mmol／L消炎痛、含lO％FBs的高糖DMEM成脂誘導(dǎo)體系繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)3天，每隔3～4天換液1次。對(duì)照組：24h后更換含lO“∥ml的牛胰島素、l∞舒BS的高糖DMEM培養(yǎng)基，每隔3q天換液1次。誘導(dǎo)后細(xì)胞用PBS洗滌3次，油紅0染色5～10min，光鏡下觀察。隨機(jī)數(shù)取lO個(gè)非重疊視野(×100)，計(jì)算脂肪細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，結(jié)果用i±S表示；用免疫組化和RFPCR方法測(cè)定兩組細(xì)

5、胞PPf嘶表達(dá)水平。2．隨機(jī)分為兩組，一組為按上述方法繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)的成脂誘導(dǎo)組；另一組為在成脂誘導(dǎo)體系內(nèi)加入等體積的終濃度為1m∥ml的祛脂素的實(shí)驗(yàn)組。兩組細(xì)胞的終濃度均為2×105／ml。觀察祛脂素對(duì)此誘導(dǎo)分化的影響，光鏡下觀察細(xì)胞脂肪化程度，計(jì)算脂肪細(xì)胞陽性率；RT-PcR測(cè)定各組細(xì)胞PP舢研表達(dá)水平。3．取12例AA患者肝素抗凝骨髓液各約lOml，收集單個(gè)核細(xì)胞層，洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106／ml，每個(gè)AA患者的骨髓均分為等量的兩份，再隨機(jī)分為成脂對(duì)照組和祛脂實(shí)驗(yàn)組：對(duì)照組為將終密度為2×106／ml的貼壁細(xì)胞加入上述成脂誘導(dǎo)體系內(nèi)

6、；實(shí)驗(yàn)組為將細(xì)胞終濃度為2×106／ml的貼壁細(xì)胞加入上述成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)體系和終濃度為1m∥m1的祛脂素的混合培養(yǎng)基。接種于培養(yǎng)瓶中，370c，5％的C02，飽和濕度下孵育。每3天半量換液一次。14天后收集培養(yǎng)細(xì)胞，在光鏡下觀察細(xì)胞脂肪滴情況和用RT_PCR方法檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)PPARl，表達(dá)情況。結(jié)果：1．光鏡下觀察MSC誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞的形態(tài)變化：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)體系加入后48h，成纖維樣長梭形細(xì)胞樣的MSC中有小脂滴出現(xiàn)，主要集中于細(xì)胞核周圍，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，小脂滴逐漸聚集成大的脂泡，細(xì)胞逐漸增大，由原來的梭形變?yōu)閳A形或多角形。不同代的細(xì)胞誘導(dǎo)

7、脂肪的發(fā)生率沒有明顯的區(qū)別。對(duì)照組誘導(dǎo)3周后無變化，細(xì)胞內(nèi)沒有脂滴形成。用油紅O染色顯示誘導(dǎo)組細(xì)胞有棕紅色脂肪滴形成：而對(duì)照組則沒有棕紅色脂滴形成。誘導(dǎo)劑組脂肪細(xì)胞陽性率為86．4％士3．2％；正常對(duì)照組的脂肪細(xì)胞陽性率為0％，兩組之間有顯著性差異(P<0．05)。誘導(dǎo)組細(xì)胞PPA聊表達(dá)水平比正常組PPf～腳表達(dá)水平明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

8、測(cè)定PPAR_丫蛋白和PP：AR吖mRNA的表達(dá)：誘導(dǎo)組細(xì)胞PPAR了的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P