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《黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶及其基因xynB克隆、表達(dá)的研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶及其基因xynB克隆、表達(dá)的研究摘要木聚糖(xylall)是一種多聚五碳糖，是植物半纖維素的重要組分，是自然界中繼纖維素之后含量第二豐富的可再生生物資源。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一類酶的總稱。目前，它在飼料、造紙、食品、制藥以及能源工業(yè)中均有著廣泛的應(yīng)用。本論文以木聚糖酶為研究對象，主要分為以下幾個部分：1．黑曲霉培養(yǎng)基的優(yōu)化。通過單因素實驗確定了黑曲霉(AS3．4309)液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最適培養(yǎng)基為：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％麩皮為碳源，以1％酵母膏為氮源，表面活性劑Tween80的添加量為0
2、．5％，無機(jī)鹽KH2P042．6％，CaCl20．5％，MgS04．7H201％，F(xiàn)eS04．7H200．016％，裝液量為50ml／250ml，培養(yǎng)的起始pH為5．0，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為72h，搖床的轉(zhuǎn)速為150r／min，在此條件下，菌株產(chǎn)木聚糖酶活性較高，能提高至76．56U／ml，是原始菌株的1．2倍。2．雙水相法純化木聚糖酶。本文利用雙水相法對木聚糖酶進(jìn)行純化，確定最佳的純化條件為：PEG4000、PEG4000濃度為19％(w／w)、K2HP04濃度為10％(w／w)、NaCl濃度為0(w／w)。在此
3、條件下，木聚糖酶的提取效果較好，K和Yt的值分別為29．34和88．67％。3．木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究。本文對黑曲霉木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：該木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為5．O，在40～50℃間的熱穩(wěn)定性較好，在pH3．0～6．0的條件范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，是典型的酸性木聚糖酶；金屬離子Fe2+、M92+、Zn2+對木聚糖酶活力有不同程度的促進(jìn)作用，A13+對木聚糖酶稍有影響，使其活力降低；而其余的大部分金屬離子對木聚糖酶的活性的影響并不大。4．基因克隆與表達(dá)。本文分別以黑曲霉基因組DNA和eDNA
4、為模板，通過PCR擴(kuò)增出得到一條約為750bp，一條約為680bp的目的片段，經(jīng)測序結(jié)果表明該基因全長746bp，含有68bp的內(nèi)含子，基因編碼區(qū)長678bp，該基因己提交GeneBank，登錄號為EU423881。將測序所得正確的xynB基因與酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH．5a，成功構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K--xynB。后用電擊轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichm胛幻，括GSll5)，經(jīng)MM／MD快慢斑進(jìn)行篩選，并挑取數(shù)個慢斑進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，4～6天后，將其點于RBB．木聚糖平板上，可見
5、產(chǎn)生了明顯的透明圈，取上清測得的酶活為160．78U／ml，是出發(fā)菌株的2．1倍。關(guān)鍵詞：黑曲霉，木聚糖酶，發(fā)酵，基因克隆StudyonthexylanasefromAspergillusnigerandcloning，expressionofxynBgeneAbstractXylanisapoly—fivecarbonsugarandisanimportantcomponentofplanthemicelluloses，whichaccountsforone-thirdofthetotalplantcarbohydrat
6、es．Innature，Xylanisthesecondrichrenewablebiologicalresourcesjustafterthecellulose．XylanaseisakindofenzymescollectivelywhichcandegradexylanintoXylooligosaccharidesandxylose．XylanaseCandegradexylanintooligoxylose，xyloseandasmallnumberofsingle-glucose．Xylanasehasawid
7、erangeofapplicationsonfeed，paper,food，pharmaceuticalandenergyindustries．Xylanaseisstudiedinthispaper，itisdividedintothefollowingparts：1．Aspergillusnigermediumoptimization．ThesinglefactorexperimentidentifiedAspergillusniger(AS3．4309)liquidfermentationofxylanaseopti
8、mumfermentationmediumfor：usequalityscoresof2％branasacarbonsource，withl％yeastextractasnitrogensource，surfactantTween80isadded0．5％，晰th2．6％inorganicsaltKH2
