《細(xì)胞培養(yǎng)液的配制》PPT課件

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1、細(xì)胞培養(yǎng)液的配制培養(yǎng)基的選擇依據(jù):經(jīng)驗(yàn)、文獻(xiàn)、嘗試常用:RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基的來源市售干粉培養(yǎng)基---自己配制液體培養(yǎng)基---直接使用(注意有效期)培養(yǎng)基的除菌方法過濾除菌:(1)正壓過濾---效率高(2)負(fù)壓過濾---效率低高壓蒸氣滅菌:不含谷氨酰胺，滅菌后另外添加培養(yǎng)基附加成分的添加按使用說明或?qū)嶒?yàn)要求添加配制時(shí)加:碳酸氫鈉、抗生素、血清等臨用前加:生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等RPMI1640培養(yǎng)液配制過程準(zhǔn)備物品(1)不銹鋼過濾器,濾膜(0.45μm,0.22μm),磁力攪拌器,天平,燒杯,量筒,鹽水瓶(2)培養(yǎng)粉,1NHCl,NaHCO

2、3,青霉素,鏈霉素,胎牛血清,新鮮三蒸水消毒物品濾器中放置0.45μm和0.22μm濾膜,包裝,高壓蒸氣消毒配制步驟(1)10.4g/包培養(yǎng)粉溶至1L三蒸水中,磁力攪拌20min(2)加2gNaHCO3/L,繼續(xù)攪拌10min(3)加青霉素100U/mL(80萬U溶至4ml三蒸水,取0.5ml)鏈霉素100U/mL(100萬U溶至5ml三蒸水,取0.5ml))(4)加1NHCl約3mL,調(diào)pH至7.2,繼續(xù)攪拌(5)按要求加血清?。ㄑ逡话阈杞?jīng)56℃，30min滅活）例如:10%胎牛血清無血清培養(yǎng)液900ml滅活胎牛血清100ml(6)正壓過濾除菌(氣壓適當(dāng),防止濾膜破裂)(

3、7)分裝,貯存于4℃，2周內(nèi)用完。(8)無菌試驗(yàn):取樣,37℃放置24－72h,無細(xì)菌、霉菌污染方可使用注意事項(xiàng)谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，４℃，７ｄ分解５０％，放置兩周以上時(shí)，根據(jù)需要添加谷氨酰胺。配制１００×母液（200mmol/L,即29.22g/L）,每100ml加入0.5－2ml母液，終濃度1－4mmol/L抗生素在37℃穩(wěn)定性維持3－4d,可控制輕度污染。防污染重在無菌操作培養(yǎng)液配制過程（以RPMI1640為例）1.物品準(zhǔn)備(1）濾器、微孔濾膜、磁力攪拌器、天平、燒杯、量筒、pH計(jì)、貯液瓶等。(2)培養(yǎng)粉、NaHCO3、1NHCl、青霉素、鏈霉素、血清、新鮮制備的

4、三蒸水2.濾器消毒準(zhǔn)備取孔徑為0.45μm和0.22μm濾膜各一張，浸入三蒸水中將浸濕后的濾膜光面向上依次置于濾器上將裝有濾膜的濾器包裝后高壓蒸氣消毒3.液體配制①將培養(yǎng)粉倒入容器中②加入新鮮制備的三蒸水磁力攪拌器充分?jǐn)嚢琚郯凑諏?shí)驗(yàn)的具體要求分別加入NaHCO3和青鏈霉素（青霉素100U/mL：80萬U溶至4ml三蒸水,取0.5ml；鏈霉素100U/mL：100萬U溶至5ml三蒸水,取0.5ml)④按要求加入一定比例的血清（血清一般需經(jīng)56℃，30min滅活）例如:配制含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液1升，應(yīng)加入無血清培養(yǎng)液900ml滅活胎牛血清100ml⑤加入1NH

5、Cl約3mL,調(diào)整pH至7.2－7.4磁力攪拌器充分?jǐn)嚢铚?zhǔn)備過濾⑥無菌條件下裝好濾器，檢查氣體以及液體管道是否通暢。(一般使用氧氣。注意氣壓適當(dāng),防止濾膜破裂，)將液體倒入無菌濾器，接通氣體⑦過濾后的液體分裝于貯液瓶分裝過程嚴(yán)格無菌操作分裝后的液體貯存于4℃，2周內(nèi)用完。謝謝！