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1、葉綠體色素的提取分離及其理化性質(zhì)的觀(guān)察2012.3一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊虼?，測(cè)定葉綠素含量便成為研究光合作用與氮代謝必不可少的手段，在生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用。1.學(xué)習(xí)葉綠體色素的提取方法。2.了解葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的一些主要理化性質(zhì)。綠色植物的光合作用是在葉綠體色素參與下進(jìn)行的，了解葉綠體色素的組成、性質(zhì)及測(cè)定對(duì)于理解光合作用的本質(zhì)很有幫助。植物色素包括：①??脂溶性的葉綠體色素：存在于葉綠體，與光合作用有關(guān)，如葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素等； ②??水溶性的細(xì)胞液色素：存在于液泡中，與花朵的顏色有關(guān)，如花青素屬黃酮類(lèi)物質(zhì)。二、原理與操作步驟（二）葉綠體色素的提取原理和方法各種植物葉綠體
2、中所含的色素有數(shù)十種，可分三大類(lèi)。葉綠素類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)和藻色素類(lèi)（或稱(chēng)藻膽素類(lèi)）。后一類(lèi)只存在于藻類(lèi)。以下只介紹前兩類(lèi)。(一).實(shí)驗(yàn)材料：菠菜葉片。葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b，酯類(lèi)化合物）和黃色素（包括胡蘿卜素（烴類(lèi)）葉黃素（衍生的醇類(lèi)））兩大類(lèi)。它們與類(lèi)囊體膜上的蛋白質(zhì)相結(jié)合，而成為色素蛋白復(fù)合體，不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑提取。提取的操作步驟：乙醇提取液：（1）取菠菜葉片洗凈、擦干、剪碎、混勻，稱(chēng)2g，放入研缽中。（2）加入少量石英砂及碳酸鈣粉，加1～2滴管95%乙醇，研磨至糊狀；再加10～15ml95%乙醇，提取1～3
3、min，過(guò)濾于三角瓶中；殘?jiān)?ml95%乙醇沖洗，一同過(guò)濾于三角瓶中。提取的操作步驟：水研磨勻槳：另取2g剪碎的新鮮葉片，放入少量石英砂（不加碳酸鈣粉），用水研磨。先加2ml蒸餾水，研至糊狀，再加蒸餾水20ml，攪均，不過(guò)濾。為做光破壞準(zhǔn)備的乙醇提取液操作步驟：水研磨勻漿操作步驟：因吸附劑（本試驗(yàn)為濾紙）對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿?dòng)時(shí)，混合物中各成分在兩相（流動(dòng)相和固定相）間具有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動(dòng)速度不同，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間層析后，便將混合色素分離。1.提取液中各成分分離：用色層分析的原理加以分離分配系數(shù)吸附脫吸附再吸附再脫吸附葉綠體色素的結(jié)構(gòu)決
4、定極性不同，因而在濾紙上的遷移速率不同。葉綠體色素葉綠素類(lèi)胡蘿卜素葉綠素a葉綠素b胡蘿卜素葉黃素葉綠素的化學(xué)結(jié)構(gòu)細(xì)菌葉綠素a葉綠素a葉綠素b卟啉植醇葉綠醇烴類(lèi)衍生的醇類(lèi)吸附劑：濾紙推動(dòng)劑：石油醚:丙酮:苯（10:2:1）步驟：（1）圓形定性濾紙1張（直徑11cm），用細(xì)頭的吸管在其中心戳一圓形小孔（直徑約3mm）。（2）另取一張濾紙條（5cm×1.5cm），沿紙條長(zhǎng)度方向涂色素，限制在0.5cm，風(fēng)干后，重復(fù)涂抹數(shù)次。沿長(zhǎng)度方向卷成紙捻。涂抹色素要適量，量多拖尾，量少色帶看不清。涂抹色素的技巧方法：將色素放到一塊平板玻璃上，涂抹紙片，這樣涂抹的色帶窄，分離效果好。（3
5、）紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，與濾紙平齊（勿凸出）。（4）康維皿放置培養(yǎng)皿內(nèi)，康維皿中央小室中加滿(mǎn)推動(dòng)劑。（5）把帶有紙捻的圓形濾紙平放在康維皿上，使紙捻下端浸入推動(dòng)劑中。蓋好培養(yǎng)皿(為什么？)。（6）推動(dòng)劑到達(dá)濾紙邊緣時(shí)，取出濾紙，風(fēng)干。用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置和名稱(chēng)。（7）剪下一部分附到實(shí)驗(yàn)報(bào)告中。注意：1、色素多涂抹幾次，風(fēng)干后再涂抹第二次。細(xì)，勻，直，濃。2、涂抹的色素要適量，量多易發(fā)生拖尾，量少色帶看不清；3、紙捻卷緊；4、色素涂抹的寬度不要超過(guò)紙條的二分之一；5、中心孔要小而圓；平齊，勿突出；6、分離時(shí)一定要蓋嚴(yán)，防止推動(dòng)劑蒸發(fā)。顏色從外往內(nèi)分
6、別是橙黃色、黃色、藍(lán)綠色和黃綠色。分別為：？實(shí)驗(yàn)結(jié)果：標(biāo)出各種色素名稱(chēng)（1）.光對(duì)葉綠素的破壞作用葉綠素（a，b）的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類(lèi)胡蘿卜素則較穩(wěn)定。（提取出葉綠素后先做這一步）用15N研究燕麥葉片中色素的合成和分解發(fā)現(xiàn)，72小時(shí)全部更新一遍。2.葉綠體色素的理化性質(zhì)光對(duì)葉綠素破壞的操作步驟：稀釋時(shí)不用嚴(yán)格定量？稀釋2-3倍，為什么要稀釋?zhuān)克崛∫喊倒庖掖继崛∫喊倒庾⒁猓荷匾掖继崛∫旱臐舛忍螅仨氝M(jìn)行稀釋才能做光破壞實(shí)驗(yàn)，稀釋倍數(shù)視提取液的濃度確定，濃度不要過(guò)大，否則在短時(shí)間之內(nèi)效果不明顯。光下破壞
7、的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)，否則看不到效果。陰天可以適當(dāng)延長(zhǎng)，時(shí)刻觀(guān)察。陰天和晚上上課的同學(xué)取濾紙一張，將兩種液分別涂抹在濾紙上，帶回去，放在光下處理。水研磨勻漿液乙醇提取液置于光下10分鐘折疊剪開(kāi)置于暗處（2）、熒光現(xiàn)象葉綠素的熒光:葉綠素酒精溶液在透射光下為翠綠色，在反射光下為棕紅色。這紅光就是葉綠素受光激發(fā)后發(fā)射的熒光。葉綠素酒精溶液的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，約達(dá)其吸收光的10％左右，而鮮葉的熒光強(qiáng)度較低，只占其吸收光的0.l～1％。當(dāng)熒光出現(xiàn)后，立即中斷光源，用靈敏的光學(xué)儀器還可在短時(shí)間內(nèi)看到紅色“余暉”，這是磷光。如果提取液的濃度較低，無(wú)法觀(guān)察到熒光。葉綠素的熒
