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《豬圓環(huán)病毒2型抗體間接ELISA檢測試劑盒的研制和應用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、中國農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文豬圓環(huán)病毒2型抗體間接ELISA檢測試劑盒的研制和應用姓名：李寧申請學位級別：碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：楊漢春;郭鑫20040601中文摘要利用已構(gòu)建的基因工程重組菌BL21(DE3)表達豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)ORF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白．并成功摸索出一種快速純化該蛋白的方法。用純化的蛋白作為包被抗原，建立了檢測豬血清中PCV2抗體的問接ELISA方法；以該方法為基礎(chǔ)初步組裝出試荊盒，并進行了初步應蹦。對ELISA的反應條件進行了探索，確定了最適工作條件。結(jié)果表明，重組蛋白抗原的昂適包被濃度為O．199／mL，最適包被條件為37"C2h加4"C過夜；待檢血清的
2、稀釋度為1：40；HRP．兔抗豬IgG的工作濃度為1：800；待檢血清和酶標二抗的反應條件和反應時間均為37"C30min：底物室溫顯色10-15min：陰陽性臨界值為0．4。經(jīng)阻斷試驗、交叉反應試驗和重復性試驗，表明建立的間接ELISA方法是特異的，且重復性很好；與間接免疫熒光試驗(IFA)進行比較，其敏感性和特異性分別是94．3％和90％，說明兩種檢測方法間無顯著性差異：進行了試劑盒的組裝及其保存期試驗，結(jié)果表明試劑盒在4℃下至少可保存三個月。用試劑盒檢測人工感染PCV2組織毒的SPF小香豬血清，并繪制血清中抗體變化的動態(tài)曲線。結(jié)果顯示，攻毒后14,--2l天血清抗體出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)化，抗
3、體水平的高峰期出現(xiàn)在感染后28---35天，其后，抗體水平開始下降。用試劑盒對我國13個地區(qū)70個規(guī)模化養(yǎng)豬場的2007份豬血清進行了PCV2感染的普查，結(jié)果表明自1997年以來PCV2感染已在我國普遍存在。關(guān)鍵詞：PCV2：重組蛋白：ELISA；試劑盒；應用AbstractInthisstudy，thestructuralproteinencodedbyORF2ofPCV2wasexpressedinrecombinantE．coliBL21(DE3)andavalidmethodofpuri5，ingthePCV2-ORF2recombinantfusionproteinwasde
4、veloped．Usingthepurifiedrecombinantproteinascoatingantigen，anindirectELlSAwasestablishedfordetectionofantibodyinsernmtoPCV2．ELISAkitwasprimarilypreparedandappliedfordetectionofantibodiesinserunlsamplesfrompigletsinfectedexperimentallyandswinefarms．Thevario／isfactorsandconditionsforELISAwereexplo
5、red．a(chǎn)ndtheoptimalreactionconditionsweredetermined．ItwasshownthattheoptimalconcentrationofPCV2-ORF2mcombinantproteinforcoatingofplatewas0．1gg／mL，theoptirealcoatingconditionofmcombinantproteinwas3TCfor2hoursand4"Covemight，thedilutionofserumsamplewasl：40．theworkingconcentrationofHRP-labeledrabbitan
6、ti-proteinIgGwas1：800，sevtllnsampleforde'reefingandHRP-labeledrabbitanti·porcineIgGshouldbemcubatedat37"Cfor30minbeforeterminatedwiththestoppingsolution．ThethresholdforELISAwas0．4．TheblockingtestforthereactionbetweenthepositiveserulnofPCV2andtherecombinantproteinwascarriedoutbyusingPCV2harvested
7、incellculture．TheresultsindicatedthatPCV2couldblockthereactioncompletely．Itwasalsoconfirmedthattherewasnocrossreactionbythecrossingtest．Meanwhile，theELISAhadidealrepeatabilitywhileitwasdonebothinthesamedayandthedifferentdays
