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《藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白細(xì)胞工程體內(nèi)重組》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要藻膽蛋白是藍(lán)藻中的捕光蛋白，其生物合成的重要一步是藻膽色素與脫輔基蛋白的連接。大多數(shù)藻膽色素的正確連接都需要結(jié)合位點(diǎn)專一和對色素的構(gòu)象有選擇性的裂合酶來催化完成。在集球藻Synechococcussp.PCC7002中，裂合酶CpeS能催化a-APC81位半胱氨酸殘基與藻藍(lán)膽素（PCB）的連接。裂合酶CpcE/CpcF可催化CpcA中Cys-84與PCB的連接。本課題利用分子生物學(xué)方法得到含cpcA、cpcE、cpcF基因的各種質(zhì)粒并表達(dá)了相應(yīng)蛋白。通過體外重組實(shí)驗(yàn)證明：蛋白CpcA在CpcE/CpcF
2、催化下與PCB結(jié)合形成天然產(chǎn)物CpcA-PCB；而在缺少CpcE/CpcF的情況下，蛋白CpcA與PCB結(jié)合形成非天然產(chǎn)物（CpcA-PCB、CpcA-MBV的混合物）。同時(shí)，通過體內(nèi)重組證實(shí)：體內(nèi)產(chǎn)生的PCB在有無CpcE/CpcF的情況下均能與蛋白CpcA結(jié)合并形成天然產(chǎn)物，所以在生物體內(nèi)CpcA與PCB能進(jìn)行一定程度的自催化連接反應(yīng)并形成天然產(chǎn)物，通過熒光光譜計(jì)算其自催化比例為0.2％。本課題還通過體內(nèi)重組實(shí)驗(yàn)證明：裂合酶CpeS對a-APC81位半胱氨酸殘基與藻藍(lán)膽素（PCB）的連接有一定的催化作用，但在缺少CpeS的情況
3、下，體內(nèi)產(chǎn)生的PCB與ApcA結(jié)合形成天然產(chǎn)物的現(xiàn)象也十分明顯，通過熒光光譜計(jì)算其自催化比例可達(dá)到56％。本課題是針對脫輔基藻膽蛋白與藻藍(lán)膽素連接方式的研究，將有助于研究藻膽蛋白的生物合成以及藻膽體的組裝，有助于藻藍(lán)膽素色素蛋白的蛋白質(zhì)工程優(yōu)化的研究。關(guān)鍵詞：裂合酶CpcE/CpcF裂合酶CpeS別藻藍(lán)蛋白a亞基藻藍(lán)蛋白a亞基體內(nèi)重組華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractPhycobiliproteinsarelight-harvestingproteinspresentincyanobacteria.Themostimport
4、antstepinphycobilinbiosynthesisisthephycobilinadditiontotheapophycobiliproteins.Invivo,thecorrectattachmentofmostchromophoresiscatalyzedbybinding-siteandchromophore-specificlyases.Asweknownow,thecovalentattachmentofphycocyanobilintothea-subunitofA-phycocyanin,ApcA,isc
5、atalyzedbyCpeS.Andthecovalentattachmentofphycocyanobilintothea-subunitofC-phycocyanin,CpcA,iscatalyzedbyCpcEandCpcF.Inthiswork,Molecularbiologytechniquewasusedtoconstructexpressionplasmidscontainingsuchgenes:ascpcA、cpcE、cpcF,thenthecpcAwasintroducedintoE.coli.WithCpcE
6、andCpcF,theholophycobiliproteinsPCB-a-CPCwassynthesizedinvitro.ButWithoutCpcEandCpcF,PCB-a-CPCwasnotobtained.WealsoprovethatweatherCpcEandCpcFexistedornot,theholophycobiliproteinsPCB-a-CPCwassynthesizedinvivoreconstitution.About0.2％oftheapo-CpcAwasconvertedtoholo-CpcA
7、-PCBinasimilarlyengineeredE.colistrainthatlackscpcEandcpcF.Inthiswork,WealsoprovethatweatherCpeSexistedornot,theholophycobiliproteinsPCB-a-APCwassynthesizedinvivoreconstitution.About56％oftheapo-ApcAwasconvertedtoholo-ApcA-PCBinasimilarlyengineeredE.colistrainthatlacks
8、cpeS.Inthiswork,westudiedwaysofphycobilinadditiontotheapophycobiliproteins.Itisusefulforustofindbetterwaysofstudyingphycocya
