土壤中熒光假單胞菌的分離及鑒定

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1、微生物學實驗方案土壤中熒光假單胞菌的分離及鑒定實驗方案本組成員：張清玫、趙良燊、周紅梅聯系方式：177805179431微生物學實驗方案一、實驗目的1.1學習和掌握培養(yǎng)基的一般配置方法和步驟1.2學習和掌握分離純化技術的概念1.3學習掌握涂布稀釋分離微生物的技術1.4學習假單胞菌屬的生活習性和主要種類1.5較為深入了解熒光假單胞菌的生物學特性和應用二、實驗原理2.1熒光假單胞菌2.1.1熒光假單胞菌（P.Fluorescens），分類學上屬于細菌域、變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、假單胞菌科的假單胞菌屬。細胞為直的桿菌，大小為0.7-0.8

2、X2.3-2.8微米，不產芽孢，革蘭氏染色陰性。有數根極生鞭毛，運動。需氧,進行嚴格的呼吸型代謝,以氧為最終電子受體。能以硝酸鹽為替代的電子受體進行厭氧呼吸?；軤I養(yǎng)異養(yǎng)，不需要有機生長因子。氧化酶陽性，接觸酶陽性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能從蔗糖合成果聚糖，明膠液化。生長溫度范圍4-37℃，最適生長溫度是25-30℃。DNA中G+C含量是60-61%。廣泛分布于自然界，如土壤、水、植物及動物活動環(huán)境中。該菌生化能力活躍，可降解許多人工合成化合物，常被用于環(huán)境保護。能分泌黃綠色熒光色素發(fā)出熒光，能產生抗生素、水解酶等代謝產物，在4℃-37℃

3、范圍內，中性環(huán)境中生長，生理生化特性顯著，是作為嗜冷菌是牛奶中危害最大的微生物。2.1.2熒光假單胞菌抑菌活性的最佳發(fā)酵配方和培養(yǎng)條件為：果糖1.5％、蛋白胨3.0％、KH2PO40.1％、NaCl0.04％、CaCO30.1％，起始pH為7.2，裝瓶量50ｍＬ／250ｍＬ，28℃，200r／min，種子液接種量為10％，搖瓶培養(yǎng)4d。2.2平板劃線分離法平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而

4、淘汰一些不需要的微生物。平板劃線分離法是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞，經培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當作待分離微生物的純本組成員：張清玫、趙良燊、周紅梅聯系方式：177805179432微生物學實驗方案種。有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的2.3熒光假單胞菌的鑒定在KMB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后可形成1.2mm菌落，菌落可產生橙色色素，

5、圓形，表面凸起，光滑，較粘稠，易挑起，邊緣整齊。在電鏡下觀察可看到細菌發(fā)出黃綠色熒光。三、實驗材料試劑與器具3.1實驗材料江安校園植物根部附近土壤3.2實驗試劑3.2.1KMB培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨20g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂1.5g，瓊脂10g，無菌水1000ml。pH值7.2±0.2。3.2.2十六烷基三甲基溴化銨瓊脂配方如下蛋白胨10g；牛肉膏3g；氯化鈉5g；瓊脂13g；十六烷基三甲基溴化銨0.3g；pH7.5±0.1。3.3實驗器材移液槍，試管，錐形瓶，量筒，天平，鑰匙，剪刀，錫紙，標簽紙，線繩，酒精燈，石棉網，借種環(huán)，培養(yǎng)皿等

6、。四、實驗步驟4.1KMB培養(yǎng)基配制按培養(yǎng)基配方比例依次推確地稱取蛋白胨20g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂1.5g，放人盛有100ml無菌水的錐形瓶溶解。手搖錐型瓶使之完全溶解。溶解后定容至250ml。取出20ml于試管中蓋好蓋子，向錐型瓶是剩余的液體中加入10g瓊脂加熱溶解。本組成員：張清玫、趙良燊、周紅梅聯系方式：177805179433微生物學實驗方案4.2十六烷基三甲基溴化銨瓊脂配制按培養(yǎng)基配方比例依次推確地稱蛋白胨10g；牛肉膏3g；氯化鈉5g；十六烷基三甲基溴化銨0.3g；放人盛有50ml無菌水的錐形瓶溶解，定容至100ml?；旌先?/p>

7、解后加入瓊脂13g加熱溶化。4.3滅菌將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，121℃，20min高壓蒸氣滅菌。4.4倒平板待其冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成平板。配制KB培養(yǎng)基16個，十六烷基三甲基溴化銨瓊脂3個。倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將輕輕地撥出，瓶口保持對著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住管瓶塞(也可將瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內或三角瓶內的培養(yǎng)基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中)。左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅

8、速例入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。4.5無菌檢查將滅菌培養(yǎng)基放人=溫室中培