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《雞MHCⅡαβ鏈基因的克隆和原核表達(dá)及其抗體制備》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、中文捅蔓主要組織相容性復(fù)合體(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是由緊密連鎖的高度多態(tài)的基因位點(diǎn)所組成的位于染色體上一個(gè)遺傳區(qū)域，廣泛存在于所有脊椎動(dòng)物，具有高度的多態(tài)性和保守性。該基因區(qū)編碼的蛋白通常稱為MHC分子或MHC抗原，是移植物排斥的主要決定簇。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可將MHC分為I、II、III三類。其中，MHCII類分子是由2條非共價(jià)結(jié)合的多肽鏈(o【鏈和B鏈)構(gòu)成的糖蛋白，它們由不同的MHC基因編碼。c【鏈(32000～34000)比B鏈(29000～32000)略大，2條鏈均含有寡
2、糖，旺鏈糖基化程度較高。結(jié)構(gòu)上I類分子和II類分子均可分成肽結(jié)合區(qū)、Ig樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)4個(gè)部位。MHCII類分子選擇性地分布于有免疫功能的細(xì)胞如B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、激活的T細(xì)胞等細(xì)胞膜上。MHC的主要功能是遞呈抗原肽段，通過(guò)MHC．抗原肽復(fù)合物活化、誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫應(yīng)答。MHCII類分子遞呈的抗原主要是外源性抗原。為了探索雞MHcII類分子在免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)理，本研究運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行了克隆、表達(dá)和鑒定。首先，根據(jù)GenBank中登錄的雞類MHCII的o【鏈和D鏈基因序列與載體DG
3、Ex-4T-1的多克隆酶切位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，利用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT．PCR)從有絲分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激18h活化的雞脾淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出相應(yīng)大小的a鏈(77lbp)和D鏈(798bp)的基因；經(jīng)酶切鑒定，所擴(kuò)增的a鏈和§鏈基因片段含有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)：然后將這兩個(gè)片段分別插入載體pGEX．4T．1中，并轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，經(jīng)雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pGEX一4T一1／a和pGEX-4T-1／13后，對(duì)Ⅱ鏈和D鏈的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明本研究成功地克隆了雞MHCII的a鏈和B鏈基因，它們分別編碼771和79
4、8個(gè)核苷酸。與GeneBank登錄的儀鏈基因(登錄號(hào)：AY357254)相比較，只有四個(gè)核苷酸的差異，同源性為99％，導(dǎo)致2個(gè)氨基酸的改變。同樣，與GeneBank登錄的B鏈基因(登錄號(hào)：$66480)相比較，有42個(gè)核苷酸的差異，同源性為95％，導(dǎo)致27個(gè)氨基酸的改變。其次，將上述構(gòu)建成功的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX．4T一1／IXSfnpGEX．4T一1／B，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)異丙基一B-D一硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，表達(dá)出含有谷胱甘肽一S一轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白GST—d和GST—p；對(duì)表達(dá)條
5、件進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化，確定了最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度；對(duì)表達(dá)蛋白的可溶性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白GST．程和GST．p均以包涵體形式存在；利用優(yōu)化的原核表達(dá)條件對(duì)含有質(zhì)粒GST．0【和GST．D的BL21菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)反復(fù)凍融和超聲裂解誘導(dǎo)菌，獲得濃度較高的GST—d和GST-p包涵體蛋白，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，溶解的包涵體通過(guò)谷胱甘肽瓊脂糖親和層析獲得純化的GST．a(chǎn)和GST—D融合蛋白。最后，利用上述純化的GST—d和GST．B融合蛋白作為抗原分別免疫小鼠制備鼠抗雞0【鏈和B鏈
6、多克隆抗體。瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)表明制備的兩種多抗均具有良好的抗原性。綜上所述，本研究成功地克隆了雞的II類MHC的cc鏈和D鏈基因，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行了原核蛋白表達(dá)和純化，并制備了效價(jià)高、反應(yīng)性和特異性強(qiáng)的鼠源抗雞II類MHC的a鏈和D鏈多克隆抗體，為進(jìn)一步研究雞的II類MHC基因的免疫功能和生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：雞MHCIIa鄺鏈克隆原核表達(dá)多抗制備AbstractThenlajorhistocompatibilitycomplex(MHC)isanextendedclusterofgeneswit
7、hextraordinarypOlymorphismandcompactlinkageinthechromosome，spreadingoverallvertebrates．MHCmoleculesarealsoconsideredastheprimarydeterminantsinthetransplantrejection．Accordingtotheirstructureandfunction，MHCmolecuIescouldbedividedintoclassI，IIandIII．ClassIImoleculesar
8、eglycoproteinsthatareformedbytwononcovalence—associatedchains，0【(32000～34000)andB(29000～32000)，eachofwhichisencodedbydifferentMHCgenes。Lik
