廣州管圓線蟲Cystatin的基因克隆、重組表達及鑒定

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1、廣州管圓線蟲Cystatin的摹岡克降、重組表達與箍定中山大學博士學位論文廣州管圓線蟲Cystatin的基因克隆、重組表達及鑒定專業(yè)：病原生物學博士生：劉玉紅指導老師：吳忠道教授摘要研究目的廣州管圓線蟲病是一種食源性寄生蟲病，人因生食含有廣州管圓線蟲第三期幼蟲的淡水螺而感染。自2006年在北京廣州管圓線蟲病疫情暴發(fā)以來，廣州管圓線蟲的研究再次引起廣泛重視。但有關(guān)廣州管圓線蟲的基礎(chǔ)研究如關(guān)鍵致病基因的鑒定及其致病機制的報道較少。廣卅I管圓線蟲感染主要引起以嗜酸性粒細胞浸潤為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，因此，嗜酸性粒細胞的浸潤及其免疫病理的調(diào)

2、節(jié)是研究重點，而蟲源性分子的篩選與鑒定是研究的熱點之一。半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin)是一類廣泛存在于病毒、細菌、動植物、哺乳動物體內(nèi)的蛋白酶抑制劑，參與多種生理與病理過程，如蛋白質(zhì)的分解代謝、感染與免疫、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等。Cystatin不僅具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，而且還具有免疫調(diào)節(jié)活性。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，寄生蟲分泌的cystatin樣分子能下調(diào)宿主的免疫反應(yīng)，可能還與寄生蟲與宿主的共進化有關(guān)。但目前還未見廣州管圓線蟲cystatin樣分子的研究報道。本課題組在開展廣州管圓線蟲基因組研究時，通過對EST序列的分析，發(fā)現(xiàn)

3、了一個具有cystatin特征的序列。在此基礎(chǔ)上，我們開展了廣州管圓線蟲cystatin(AcCystatin)的功能研究，為闡明AcCystatin在寄生蟲感染或寄生蟲與宿主的相互作用中的精確機制提供依據(jù)。兒廣州管圓線蟲Cystatin的基囚克隆、霞組表達與鑒定中山大學博十學位論文研究方法1．利用在線生物信息學方法，對AcCystatin的基因編碼序列及氨基酸序列進行分析。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從廣州管圓線蟲第四期幼蟲cDNA中擴增AcCystatin的全編碼序列，并將其克隆入載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建原核表達AcCystati

4、n的重組質(zhì)粒，并進行重組表達AcCystatin(rAcCystatin)。2．采用多種鑒定方法對rAcCystatin進行鑒定，包括半胱氨酸蛋白酶抑制活性、免疫學活性以及蛋白質(zhì)譜鑒定等。3．用RT—PCR方法檢測AcCystatin在蟲體不同時期的表達。用免疫熒光定位方法檢測AcCystatin在蟲體的分布特點。4．免疫BALB／C小鼠，獲得抗rAcCystatin的免疫血清；采用ELISA法測定免疫小鼠血清中特異性抗體滴度及其抗體亞型，用WesternBlot技術(shù)對rAcCystatin進行抗原性和免疫原性鑒定。5．分離培養(yǎng)大小

5、鼠骨髓來源的樹突狀細胞(BMDC)，利用流式細胞技術(shù)檢測rAcCystatin對BMDC表型的影響。6．利用大小鼠腹腔巨噬細胞進行rAcCystatin誘導一氧化氮(NO)產(chǎn)生的體外實驗，并根據(jù)生物信息學預(yù)測結(jié)果，對AcCystatin序列中可能的與刺激NO產(chǎn)生相關(guān)的結(jié)構(gòu)域進行基因定點突變，構(gòu)建表達突變體蛋白的原核表達重組質(zhì)粒，并進行重組表達。7．采用細胞學技術(shù)評價AcCystatin的突變蛋白對巨噬細胞產(chǎn)生NO的影響。研究結(jié)果1．AcCystatin的序列特征①hcCystatin具有cystatin超家族成員的典型序列特征，為I

6、I類cystatin。②AcCystatin典型的序列特征含有保守結(jié)構(gòu)域?半胱氨酸蛋白酶活性抑制結(jié)合區(qū)域(cystatinG—QVVAG～Pw)，理論上預(yù)測AcCystatin具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。AcCystatin序列中可能存在與NO活性有關(guān)的基序。③在同源進化上，AcCystatin與線蟲cystatin較為接近，而與人、大鼠和小鼠的cystatin遺傳距離較遠。2．AcCystatin基因的克隆和表達①在生物信息學分析的基礎(chǔ)上，從廣州管圓線蟲第四期幼蟲cDNA中克隆到Ill廣州管廁線蟲Cystatin的皋岡克降、重組表

7、達與鑒定中山大學博士學位論文AcCystatin全編碼基因序列；RT-PCR結(jié)果顯示AcCystatin在第三期、第四期幼蟲及成蟲均有表達。②構(gòu)建了rAcCystatin高效表達體系，并獲得了具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的可溶性rAcCystatin。3．rAcCystatin的免疫學活性鑒定①WesternBlot結(jié)果顯示：感染廣州管圓線蟲大鼠的血清不能識別rAcCystatin，而感染小鼠的血清能識別rAcCystatin。②rAcCystatin免疫小鼠可產(chǎn)生特異性抗體，并能識別AC粗抗原(包括ES、幼蟲及成蟲抗原的相應(yīng)蛋白條帶

8、)，其抗體亞型以IgGl增高為主，其次為IgG2b和IgG2a。③流式細胞檢測結(jié)果顯示：受rAcCystatin刺激后，大鼠BMDC的表型分子無明顯變化(0162除外)，小鼠BMDC的表型分子表達明顯增加(包括NtCII)。4．rAc