FISH實驗標(biāo)準(zhǔn)操作程序(FISH實驗資料一)

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1、FISH實驗標(biāo)準(zhǔn)操作程序（成都新基因格實驗室內(nèi)部完整版）一實驗?zāi)康耐ㄟ^熒光原位雜交實驗，輔助臨床醫(yī)療診斷：提高優(yōu)生優(yōu)育（產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用）、提前預(yù)防及治療病患（產(chǎn)后診斷及膀胱癌診斷等）、對腫瘤確診病人評估預(yù)后及中位生存期、無病痛生存期(Dsease-FreeSrvival,DFS)，指導(dǎo)用藥及治療方案（針對乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因診斷，針對CML患者的bcr/abl融合基因診斷等）。二實驗原理利用DNA堿基對的互補性，將直接標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補的目標(biāo)樣本的DNA(玻片上的

2、標(biāo)本)雜交,通過觀察熒光信號在染色體上的位置反映相應(yīng)染色體的情況三儀器設(shè)備及耗材（一）儀器設(shè)備：①：全自動分子雜交儀②：熒光顯微鏡及分析軟件③：恒溫水浴箱3個以上（小型號）④：冰箱2臺（提供試劑和標(biāo)本存放，4攝氏度和-20攝氏度）⑤：離心機（用于羊水標(biāo)本以及血液標(biāo)本，絨毛標(biāo)本處理過程的離心）⑥：通風(fēng)櫥（配固定液，等操作）⑦：迷你離心機（探針，緩沖液的離心?？呻x1.5ml管、0.2ml管）⑧：考普林瓶15個（FISH實驗中盛放各種試劑，溶液）⑨：移液槍（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于

3、雜交室和制備室。10：震蕩混勻器11：計時器，溫度計，溫度濕度顯示器。12：載玻片盒（用于存放已經(jīng)FISH實驗后的FISH片子）13：洗耳球，吸量管（10ml）,燒杯，容量瓶，電子天平，常用天平稱。（二）耗材：載玻片（最好，帶磨砂的，寫用鉛筆患者編號，因為不帶磨砂的貼標(biāo)簽會被乙醇洗掉。）大蓋玻片（方形，用于鏡檢）小蓋玻片（方形或圓形，圓形佳，用于分子雜交時候封片）離心管（10ml，1.5ml，200ul）3ml一次性吸管個人防護(hù)用品,標(biāo)簽紙等。四實驗樣本及試劑樣本：外周血，骨髓血，羊水，尿液，病理組

4、織切片等。試劑：4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、0.075MKcl、1MHcl、PBS緩沖液、0.08mg/ml胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶K工作液、檢測試劑盒等。（二）各種溶液的配制2.1：制NaOH溶液a)用天平稱取4克分析純的NaOH固體，置于一只三角燒瓶中。b)用200ml量筒準(zhǔn)確取100ml蒸餾水，緩緩注入盛放NaOH固體的三角燒瓶中。c)搖蕩三角燒瓶使NaOH固體充分溶解。d)然后緩緩傾倒入250ml廣口瓶中，密封保存?zhèn)溆谩?.2：配制20XSSC

5、溶液：取氯化鈉175.5g和檸檬酸三鈉88.2g，加入1000ml雙蒸水中，用磁力攪拌棒攪拌，使其完全溶解，用濾紙過濾，調(diào)pH為5.3，封口膜封好，4℃保存?zhèn)溆?，有效?個月。2.3：配制2XSSC溶液：用20×SSC和雙蒸水，按1:9的比例稀釋，調(diào)pH為7.0,封口膜封好，4℃保存?zhèn)溆?，有效?個月。2.4：2×SSC/0.1%NP-40配制50ml20×SSC(pH5.3)0.5mlNP-40449.5ml雙蒸水500ml調(diào)pH為7.0,封口膜封好，室溫保存?zhèn)溆?，有效?個月。2.5：系列酒精的

6、配制取無水乙醇28ml和34ml，分別與12ml和6ml雙蒸水混合，配成70%和85%的酒精，與無水乙醇共同組成70%，85%，100%的系列酒精，封口膜封好，室溫保存?zhèn)溆?；另配制一上述系列酒精，封口膜封好?20℃室溫保存?zhèn)溆谩?.6：PBS緩沖液：PBS1L配方（pH7.4）：磷酸二氫鉀(KH2PO4)：0.27g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：1.42g，氯化鈉(NaCl)：8g，氯化鉀(KCl)0.2g，加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L。高溫高

7、壓滅菌后室溫保存。2.7：0.075MKcl低滲液：鉀5.59g加入1000ml去離子水中溶解（或Kcl2.794g溶入500ml去離子水中），備用，4攝氏度低溫保存。2.8：固定液：按甲醇（AR）：冰乙酸(AR)=3:1的比例配制細(xì)胞固定液，細(xì)胞固定液現(xiàn)配現(xiàn)用。2.9:1MHcl：取.9ml濃Hcl加去離子到100ml混勻，4℃保存?zhèn)溆谩１４?個月。2.10：0.08mg/ml胃蛋白酶工作液：A：取40mg胃蛋白酶，放入1.5MLEP管中，加1ml去離子水溶解，分裝到10個200ul離心管中。B：

8、次使用時，在考普林瓶中加50ml去離子水，加入500ul1MHcl，加入一管分裝的胃蛋白酶溶液（100ul）。2.11:200ug/mlPK工作液：aPK儲存液（20mg/ml）：稱取0.1g蛋白酶K干粉溶于2XSSC（PH=7.0）溶液中，輕輕搖動，直至PK完全溶解，不要漩渦混勻。-20℃保存。b蛋白酶K工作液（200ug/ml）：取0.4mlPK儲存液溶于40ml2XSSC（PH7.0）溶液中。五實驗步驟（一）：羊水樣本FISH實驗SOP一：標(biāo)本預(yù)處理①：將新鮮收