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《咖啡α半乳糖苷酶基因的克隆與表達研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文咖啡α-半乳糖苷酶基因的克隆與表達研究姓名：梁素鈺申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：作物遺傳育種指導(dǎo)教師：鄭學(xué)勤2003.5.1咖啡Q一半乳糖靜酶基因的克隆與表達研究摘要a．半乳糖苷酶(a—D—galactosidase，a—Gal，Ec3．2，1．22)是一種外切柵營酶，廣{慧存在于生物界中．不同來源的n—Gal分子量介予28OOO～370000之問，有單體、二聚體、蘭聚體與四聚體形式．由于菜些來源的n·G8l具有血搿轉(zhuǎn)換的特殊功能，對該酶的研究越來越多，從咖啡來源的a—Gal在做瓔轉(zhuǎn)換方
2、而的效萊表現(xiàn)最好，目前，采用生物工程手段進行研究融開始為科技界所關(guān)注。編碼小粒種嘲H镕(CD虎口口陽6耙d)口一G8l靜cD黼約為13懿bp，編碼377個羝基酸，耨成熬躲編弼K豁cB融鯰菇le鵲bp。壤稻383個氮薹馥。本硬鰹勢褰競隆7大粒秘粕唪(e電琚d，i69，幻口)與中粒手巾期贍《cQ駱#c口"肇^#r8)鰓a一強l戒熟敷縭羈囂鴕cD姒，囂怎利用二靜微生物表達系統(tǒng)進行鬟級發(fā)酵襲然灼蜞究，研究結(jié)果如下：1．利用試劑盤的改進方法，簡便、快捷而有效地提取到質(zhì)最照好的熱帶f1：物咖啡的總RNA，壘過程僅需2h．
3、2．酋次從大粒種咖啡(c，打6e，，c口)與巾粒種咖nm(ccdn印ADr口)中，克降判n—GalcDNA的成熟肽編碼區(qū)d—Gal-DcDNA和a—GaI-ZcDNA。克隆到的a—Gal-DcDNA編碼區(qū)為1089bp，與己發(fā)表的小粒種咖懦成熟虢編碼序列1089bp有98，7誘同源往．筵有l(wèi)《處堿基發(fā)生變仡，氨萋酸發(fā)童突變靜宵8個{殼淹到鵑a—Gal．zcDNA編碼區(qū)氌為1089bp．與已發(fā)表翡，j、粒釋釃皤袋熬敖編碼滓穰1089bp存99．27甏弼深贛，箍存8赴堿纂發(fā)生交純，氯基酸發(fā)生突變靜存4令。3。將斃
4、隆副秘大粒耱與中粒秘期雄黝a—G8l基因，用翳額德畢券氏酵母尹耙☆蛔尹口s，。，婦表達載髂》PlCZaA(分泌甲簿誘導(dǎo)型)霸lpGAPzaA(分泌緞成型)，成功她構(gòu)建了4個酵母表達載體：妒lczaA／GaI—z，pPIczaA，Gal．D。pGAPzaA，Gal—Z，pGApZqA，Gal-D·4．將克隆到的大粒種咖啡的q—Gal基閩，用犬腸桿菌￡奢枷”，拍拍cD，，的分泌型表達載體pET。22b(+)．成功地構(gòu)建了1個大腸桿菌表達載體：pET．22，GaI-D。5．對重組Pp日sfDr船工程菌pPIczaA
5、，GaI，D／Gsll5、pPIczaA／Gal．≯，GSIl5、pGAPZaA緇al-D，GSIlS進行了搖瓶發(fā)酵裝達．對發(fā)酵產(chǎn)物進行FsDs．PAGE電泳，得到一條約為40KD的主條帶，確訣了ra-Ga{一D寫ra，Gal—z均稀列了表達；井對表達產(chǎn)物進行了酶活性梭測，臻粱謠朝了Fa。Gal。D每ra．Gal．z瓣英鴦活性。6．酵毋?f：稃菌搦瓶鬣酵采用甲醇誘簿銎載體pPlCzaA時，分泌表達的ra，Ga卜D的酶活在48h湃為19。ll(U，lnl)離子fa．Gal．z在43b瓣必ls。夠(u抽1)，騷島
6、質(zhì)分泌豢卻整ra-G蝴．z建692．5(掰∥L)裹}r《．Ga1．D為504．5(mg怒)。說甥朔毽}不羈種來游瓣a．G8l基霆在同一表達載體申，表達攫鴦差異；在分泌表達巾，潼自凄勢泌壁裹，酶活不一定就嶷，二者不成正比。實驗中對ra．GaI．D酶活檢測在108h村，其濺性W離迭48，22(U，m1)，麗rd．Gal．Z則為18．I8(u，mI)。7．劂一個咖啡種來源的a．Gal基因，在不同的表達載體中表達角=也有萍異．甲醇誘導(dǎo)型載體pPIczdA優(yōu)予組成型栽體pGAPzdA。8．對P加sfDr缸工程菌pPlC
7、zaA，GaI．D，GSll5進行了發(fā)酵罐發(fā)酵表達．對發(fā)酵產(chǎn)物進杼了sDS-P_AGE電泳，得到一條約為40KD的條帶，碲認了r口一G&1．D褥到了表達；并對產(chǎn)物進行酶活健檢涮，證明了ra．Gal．轉(zhuǎn)其有酶活性。9．對巨cDff：翻鶩菡pE■22，Gal—p，BL2l踅}行了搖瓶麓簿表達。對發(fā)酵產(chǎn)物進行了sDs—PAGE電泳，舀的條帶區(qū)分不鑄繭；并對發(fā)酵產(chǎn)物進簿了酶活性檢瀏，其蠢微蠢酶耀性，謊嘲該表選載體與德主藩瑤靛不逶，a+Ga}+D綦瓣麴表達。關(guān)鍵塌t8一半乳耩營酶eD掛A堯建期螓豆B—O趣型轉(zhuǎn)捷皿口4$
8、f。r括￡#o，fCIoning，Sequence，andExpressionofa-D—GalactosidasefromCoffeeBean(c匆療魯口，，6F，，f口＆I[坳口f口療哆P^D，口)Abstracta—D—galactosidase(a．GaI。E．C．3．2．1．22)isanexo—glycosidase，widelypresentinthebio—resources．The
