土壤細(xì)菌的分離及純化

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1、實驗二土壤微生物的分離純化與鑒定一、目的要求1.通過從土壤中分離純化細(xì)菌，掌握培養(yǎng)基的制備與滅菌技術(shù)、微生物的分離純化方法和無菌操作技術(shù)。2.掌握微生物的鑒定技術(shù)第一部分培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)配制培養(yǎng)基的原理，并掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2.學(xué)習(xí)幾種常用培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌的操作方法.3.進(jìn)一步熟練掌握高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。二、實驗原理（1）培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。但是，不同種類的培養(yǎng)基

2、中，一般應(yīng)含有水分、碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因素等。不同微生物對pH要求不一樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸性的，而細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)基的pH一般為中性或微堿性的(嗜堿細(xì)菌和嗜酸細(xì)菌例外)。所以配制培養(yǎng)基時，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH調(diào)到合適的范圍。此外，由于配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，如果來不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱內(nèi)，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。二、實驗原理（2）根據(jù)微生物的種類和實驗?zāi)康牟煌囵B(yǎng)基的類別如下：按成分的不同：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基的物

3、理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基的用途分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。二、實驗原理（3）目前已有各種商品化的“干燥培養(yǎng)基”成品出售。這種培養(yǎng)基是將新鮮配制的液體培養(yǎng)基用噴霧干燥法、真空干燥法、低溫干燥法或蒸發(fā)干燥法等將培養(yǎng)基內(nèi)所含的水分去掉；或?qū)⑴囵B(yǎng)基內(nèi)的各種固形成分，經(jīng)適當(dāng)處理、充分混勻，便成干燥粉末而成。使用時只要按比例加入一定量的水，經(jīng)溶解、分裝，高壓蒸氣滅菌，即可使用。這種培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是配制省時，攜帶方便，使用簡易，質(zhì)量穩(wěn)定。三、實驗器材1.藥品及試劑：根據(jù)所要制備的培養(yǎng)基準(zhǔn)備所需試劑。2.儀器及其它：試管、三角瓶、燒杯、量筒、

4、玻棒、天平、藥匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(5.5-9.0)、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、干燥箱、培養(yǎng)皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、pH試紙等四、實驗步驟——培養(yǎng)基的制備與分裝1.稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取藥品。2.熔化：在沸水浴鍋中或電爐上加熱熔化。3.調(diào)pH：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)pH至培養(yǎng)基所需pH。4.過濾：趁熱用多層紗布過濾（根據(jù)實際情況確定是否過濾）5.分裝：將溶化的固體培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上，裝試管時，注意管口不要沾上培養(yǎng)基。液體分裝裝量不超過試管的1/4，固體分裝裝量不超過試管的1/5，分裝三角瓶的量不超過三角瓶容積的一半，半固體分裝裝

5、量為試管的1/3，滅菌后垂直待凝。6.加棉塞：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能，然后包扎一層牛皮紙。試管應(yīng)先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱、日期、組別。四、實驗步驟——無菌水的制備1.用量筒量取90ml水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。2.用10ml吸管取9ml水于試管中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。四、實驗步驟——器皿的準(zhǔn)備1.培養(yǎng)皿的包裝：每10套一包，用舊報紙或牛皮紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里，加蓋扣嚴(yán)）。2.吸管的包裝：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用長紙條包扎、打結(jié)。3.玻璃涂

6、布棒的包裝：方法同吸管的包裝。4.槍尖的包裝：放入槍尖盒，牛皮紙包裝。四、實驗步驟——高壓滅菌1.將所要滅菌物品放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，根據(jù)需要設(shè)定滅菌溫度和時間（一般121℃，20min滅菌，若培養(yǎng)基中含有葡萄糖等成分時，113℃，30min滅菌）。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。2.滅菌完畢，將試管培養(yǎng)基擱成斜面，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。培養(yǎng)基冷至50℃左右，倒平板。3.將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24～48h，以檢查滅菌是否徹底。五、思考題1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)菌是無菌的？2.加壓蒸汽滅菌的原理是什么？是否只要壓

7、力表上的指針指到所需的壓力時就能達(dá)到所需滅菌溫度？為什么？第二部分微生物的分離與純化一、目的要求1.通過從土壤中分離純化細(xì)菌，掌握微生物的分離純化方法和無菌操作技術(shù)。2.初步掌握微生物的菌種保藏技術(shù)。二、實驗原理（1）自然界中各種微生物混雜生活在一起，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。土壤是微生物生活的大