實驗三葡聚糖凝膠柱層析純化蛋白質(zhì)

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1、實驗二、葡聚糖凝膠柱層析1、目的與要求：1.1、學(xué)習(xí)凝膠(Gel)層析法的基本原理；1.2、掌握葡聚糖凝膠（Sephadex）柱層　　　析的操作技術(shù)。2、概述及原理：凝膠是一類不溶于水，在水中卻有較大膨脹度和較好的分子篩功能，具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（如葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）。2.1、能用于層析的凝膠主要有下面幾種：目前主要有葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex），天然瓊脂糖凝膠（商品名為Sapharose）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio-Gel），其后還發(fā)展了凝膠的各種衍生物，如羧甲基-交聯(lián)葡聚糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基

2、-交聯(lián)葡聚糖（DEAE-Sephadex）等種類。交聯(lián)葡聚糖凝膠：是凝膠層析法中使用最廣泛的一類層析凝膠，商品名稱：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖殘基通過α－1，6糖苷鍵連接而成，葡聚糖分子之間通過醚橋（甘油基）交聯(lián)形成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)2.2、不同型號的葡聚糖凝膠(Sephadex)的選用原則：組別分離時，SephadexG－25最為常用。例如樣品中緩沖液的更換，蛋白質(zhì)的脫鹽；分級分離時（如多蛋白質(zhì)組分樣品的分離純化），應(yīng)根據(jù)待分離樣品中各組分的分子量大小和分子量分布范圍來確定型號。2.3、凝膠層析法的原理：凝膠層析是一種液

3、相層析，機(jī)理是分子篩效應(yīng)。當(dāng)洗脫開始以后，小分子可進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流程長，流動慢；大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流程短，流動快。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊”，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。層析柱的重要參數(shù)：Vt(totalvolume)Vo(outervolume)Vi(innervolume)Ve(elutionvolume)Vg(gelvolume)Vt=Vo+Vi+Vg,Ve=Vo+Kd×Vi。組分的洗脫體積（Ve）：①當(dāng)樣品的體積很少時（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。

4、②當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。③當(dāng)樣品體積很大時，洗脫體積計算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)（或半高處）。Kd是分配系數(shù)：用于衡量兩個物質(zhì)的分離分辯率，是凝膠層析的一個特征常數(shù)，只與被分離物質(zhì)分子大小和凝膠孔徑大小有關(guān)，與層析柱的長短粗細(xì)無關(guān)。Kd值的計算：Kd=(Ve-Vo)/Vi幾個特征Kd值意義：①Kd=0,則Ve=Vo，全排阻；②Kd=1,則Ve=Vo+Vi,全摻入；③0＜Kd<1,則Ve=Vo+Kd×Vi，部分摻入；④Kd>1，則Ve>Vo+Vi，如某些芳香族化　　　　　合物（P

5、he,Tyr,Trp等），SephadexG-25對它們有吸附作用。2.4、影響凝膠層析分離的因素：2.4.1、樣品的體積、粘度；2.4.2、層析柱；2.4.3、洗脫液流速的影響；2.4.4、洗脫液離子強(qiáng)度、PH的影響。2.4.1、樣品的體積、粘度：分析分離時，Vsample=1-4%Vbed；制備分離時，Vsample=10-30Vbed.相對粘度樣品液粘度與洗脫液粘度的比值。分離效果只與相對粘度有關(guān)，一般來說，相對粘度不得超過1.5―2。今天的上樣量（0.4ml）約為1%柱床體積。2.4.2、層析柱：①柱長：組別分離時，20－30厘米；分級分離

6、時，可長至100厘米；②柱徑：柱長與柱徑的比為5:1─10:1(脫鹽)，20:1─100:1(純化)。今天選用的是1cm×30cm的層析柱。2.4.3、洗脫液流速的影響：洗脫液的流速與樣品分離的分辨率相關(guān)。流速過快，會使色譜峰變形，流速過慢，樣品擴(kuò)散傾向加劇。一般流速控制在30－200ml/h。今天洗脫流速控制在1ml/min。2.4.4、洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值的影響：純化蛋白時,通常選用離子強(qiáng)度＞0.02的鹽溶液作洗脫劑，以增加樣品的溶解度和消除凝膠的吸附作用；酸性組分應(yīng)選用偏堿性洗脫液；堿性組分應(yīng)選用偏酸性洗脫液。2.5、凝膠層析法的應(yīng)用：1

7、、生物分子的分離提純；2、測定高分子物質(zhì)的分子量；3、脫鹽工具；4、高分子溶液的濃縮；5、用于去除熱原物質(zhì)。2.6、凝膠的防腐、保存：Sephadex、Sepharose等都是多糖類物質(zhì)，易于長菌，因此常在凝膠（不用時）中加入抑菌劑，使用時再除去。常用0.02％疊氮鈉或20%乙醇溶液作防腐劑。1厘米光程時，254nm處透光率為60％，280nm處透光率為100％。3、試劑、器材：3.1、層析介質(zhì)SephadexG-50；3.2、樣品（包含三個組分）：①藍(lán)色葡聚糖2000，②溶菌酶，③Trp上樣量：0.4ml/柱。3.3、洗脫液：0.15M氯化鈉，即

8、生理鹽水。3.4、層析系統(tǒng)：層析柱、恒流泵、部分收集器、核酸蛋白檢測儀、記錄儀。4、實驗操作過程：4.1、凝膠的溶脹4.2