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1、葡聚糖凝膠柱層析 分離純化蛋白質(zhì)教學(xué)目標(biāo)了解：層析技術(shù)的基本原理;有效分配系數(shù)Kav的計(jì)算。理解：葡聚糖凝膠的選擇和準(zhǔn)備。掌握：凝膠層析的原理和操作方法;有效分配系數(shù)Kav的意義。重點(diǎn)：凝膠層析的原理和實(shí)驗(yàn)步驟。分配系數(shù)與被分離分子量之間的關(guān)系。難點(diǎn)：掌握裝柱,加樣,洗脫,收集樣品的操作步驟。蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。性質(zhì)方法分子大小透析、超濾、密度梯度離心、凝膠層析等溶解度等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等電荷電泳、離子交換層析等吸附性質(zhì)吸附層析對配體分子的親和力親和層析凝膠層析
2、（又叫分子篩層析或排阻層析）指混合物隨流動相經(jīng)過裝有凝膠作為固定相的層析柱時(shí)，各組分因分子大小不同而被分離的技術(shù)。凝膠層析的基本原理凝膠：一些具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和一定孔徑的高分子化合物。分子大于凝膠孔隙范圍的物質(zhì)：隨著溶劑在凝膠顆粒間流動分子小于凝膠孔隙范圍的物質(zhì)：滲入凝膠顆粒的孔隙中凝膠層析的過程凝膠層析過程的數(shù)理關(guān)系凝膠干體積Vg外水體積Vo內(nèi)水體積Vi柱床體積Vt=1/4?D2h=Vg+Vo+Vi洗脫體積（Ve）：自加入樣品時(shí)算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)所流出的洗脫液體積。凝膠層析的分配系數(shù)分配系數(shù)Kav：表示任何一種被分離的化合物被凝膠排阻的程度。Kav與凝膠柱的
3、總體積Vt、外水體積Vo、洗脫體積Ve有關(guān)：Vt和Vo恒定，Ve隨分離物分子量的變化而變化思考：為什么分離物分子量越大Kav值越小Kav=（Ve—Vo）/（Vt—Vo）？葡聚糖凝膠柱層析法的特點(diǎn)天然凝膠：一些糖類物質(zhì)，如淀粉、瓊脂及瓊脂糖等。人工合成凝膠：葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩大類。葡聚糖凝膠（Sephadex）：由許多右旋葡萄糖單位通過1，6-糖苷鍵聯(lián)結(jié)成鏈狀結(jié)構(gòu)，再由交聯(lián)劑交聯(lián)形成不溶水的多孔網(wǎng)狀高分子化合物。型號：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15型號（G-X）分離范圍（分子量Da）適用范圍G10~G25<700~5,000脫鹽、
4、小肽等G-501,500~30,000低分子量蛋白、多肽G-753,000~70,000中、低分子量蛋白、多肽G1004,000~150,000中、高分子量蛋白G150~G2005,000~800,000高分子量蛋白Sephadex的常見規(guī)格（分級范圍）X：①交聯(lián)度。X越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子量產(chǎn)品。反之亦然。②吸水量。G-25表示：1g干膠吸水2.5mL，依次類推。本實(shí)驗(yàn)中用SephadexG50（分離分子量范圍1500~20000），以蒸餾水為洗脫劑。待分離的蛋白質(zhì)混合物：蛋白A（黃色，分子量在G50的分離范圍內(nèi)）蛋白B（藍(lán)色，分子量大于G50
5、的分離范圍）實(shí)驗(yàn)步驟凝膠的準(zhǔn)備裝柱加樣與洗脫樣品收集1.凝膠的準(zhǔn)備：稱取SephadexG501g，置于錐形瓶中，加蒸餾水約30ml，在沸水浴中煮沸1h，冷卻到室溫后再裝柱。充分溶脹后的凝膠以傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，反復(fù)2~3次。層析柱洗凈后，將層析柱燒結(jié)板下端的死區(qū)用蒸餾水充滿（注意：不得留有氣泡，可多加約1cm高水層，使柱內(nèi)凝膠通過沉積作用更加均勻），然后關(guān)閉層析柱的出口。將已溶脹的凝膠懸液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝膠沉積1～2cm時(shí)，再打開出口，繼續(xù)加入凝膠懸液至凝膠沉積約10cm高即可（注意：凝膠懸液盡量一次加完，以免出現(xiàn)不均勻或分層的凝膠帶）。
6、反復(fù)加蒸餾水，平衡10min。2.裝柱（2～3人一組）3.加樣與洗脫加樣時(shí)先將柱的出口打開，讓蒸餾水逐漸流出，待凝膠床面只留下極薄的一層蒸餾水時(shí)，關(guān)閉出口（注意：不可使凝膠柱表面干涸，可預(yù)留約0.2cm高水層）。用移液槍將200μl樣品小心加到凝膠柱表面（注意：加樣時(shí)垂直伸入柱內(nèi)，接近液面處集中滴加，動作要輕柔）。然后打開出口，使樣品進(jìn)入床面，滴加1~2倍樣品體積的蒸餾水（注意：輕柔滴加）。待樣品完全流入床內(nèi)后，再加蒸餾水進(jìn)行擴(kuò)展洗脫。4.樣品收集：樣品一旦加入后馬上用燒杯收集流出液，注意柱床上要不斷加水，直到兩種蛋白全部洗脫。倒出凝膠，清洗層析管。5.結(jié)果分析：分析
7、為什么這兩種蛋白能在凝膠柱中分離開。注意事項(xiàng)裝柱時(shí)需保持柱體垂直于水平面，在平衡完畢前不可隨意晃動層析柱，以保持凝膠柱表面平整。實(shí)驗(yàn)過程中需密切注意保持層析柱中的凝膠始終處于蒸餾水中，防止蒸餾水排空。移液器使用：選擇適當(dāng)量程正確安裝槍頭吸液第一檔，放液第二檔垂直吸液，慢吸慢放吸液后不可將槍平放使用完后調(diào)至最大量程小結(jié)凝膠層析的原理：混合物隨流動相經(jīng)過裝有凝膠作為固定相的層析柱時(shí)，各組分因分子大小不同而被分離。凝膠層析分配系數(shù)：被分離的化合物被凝膠排阻的程度。Kav=（Ve—Vo）/（Vt—Vo）葡聚糖凝膠柱層析：葡聚糖凝膠為多孔網(wǎng)狀高分子化合物及交聯(lián)
