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《不同肢端畸形中基因突變鑒定及致病機(jī)制研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、·中文論著摘要·不同肢端畸形中基因突變鑒定及致病機(jī)制研究刖舌先天性肢端畸形是人類最常見的出生缺陷之一，不僅影響肢體的外觀形態(tài)和功能運(yùn)動(dòng)，甚至使患者喪失勞動(dòng)和生活能力。近年來(lái)，隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類單基因遺傳病致病基因鑒定不斷取得進(jìn)展，各種四肢先天畸形的致病基因也逐漸被發(fā)現(xiàn)，人類先天性肢端畸形研究的數(shù)據(jù)不僅將補(bǔ)充以往動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的不足，還可以加深對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程的理解，而且可以為人類組織工程學(xué)研究和基因治療藥物的研制提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)，因此對(duì)肢端畸形的致病基因突變鑒定及致病機(jī)制研究至關(guān)重要。引起先
2、天性肢端畸形的原因有環(huán)境因素和遺傳因素兩大類。遺傳因素主要指基因突變或染色體畸變，其導(dǎo)致的肢端畸形既可單獨(dú)發(fā)生又可是某種綜合征的?部分。多種基因突變和染色體畸變都會(huì)直接引起肢端形態(tài)發(fā)生(morphogenesis)的異常，表現(xiàn)不同類型的肢端畸形，如短指(趾)(brachydactyly，BD)、缺指(趾)(ectrodactyly，ED)、多指(趾)(polydactyly，PD)和并指(趾)(syndactyly，SD)畸形等。近端指(趾)間關(guān)節(jié)粘連(proximalsymphalangism，SYMl
3、，MIM185800)以肢端骨骼融合和短指(趾)為主要表型，常被認(rèn)為是BDC(BrachydactylytypeC，MIM113100)的一部分。SYMl為常染色體顯性遺傳，致病基因是GDF5(growth／differentiationfactor5．MIM601146)或NOG(MIM602991)。缺指(趾)／手足裂畸形(ectrodactyly／split—hand／split—footmalformation，SHFM)是四肢端骨(autopod)中部指軸發(fā)育不全而剩余指(趾)呈不同模式融合導(dǎo)致
4、嚴(yán)重影響患者精細(xì)活動(dòng)的先天性肢端畸形，典型表現(xiàn)為龍蝦爪(中部指軸缺陷)或獨(dú)指(橈側(cè)指軸缺陷而無(wú)裂隙，第5指(趾)總不受累)。目前已定位的人類SHFM遺傳位點(diǎn)包括：SHFMl(7q21，MIM183600)、SHFM2(Xq26，MIM313350)、SHFM3(10q24，MIM600095)、SHFM4(3q27，MIM605289)和SHFM5(2q31，MIM606708)。SHFM3和SHFM4位點(diǎn)的致病突變已經(jīng)明確，分別是染色體10q24區(qū)域內(nèi)約O．5Mb的DNA串聯(lián)重復(fù)和染色體3q27區(qū)域內(nèi)砰
5、卯(MIM603273)基因的點(diǎn)突變。手足生殖器綜合征(Hand．foot．genitalsyndrome，HFGS，MIM140000)是累及手足和泌尿生殖系統(tǒng)的畸形，肢端畸形包括短指(趾)、延遲骨化、融合及腕骨和跗骨短小等。泌尿系統(tǒng)的異常包括輸尿管口異位、膀胱輸尿管反流和腎盂輸尿管接合處梗阻導(dǎo)致慢性腎盂腎炎、腎功能不全和。腎移植。生殖系統(tǒng)畸形包括男性的尿道下裂和女性的苗勒(氏)管融合導(dǎo)致陰道縱隔和雙子宮。HFGS為常染色體顯性遺傳，致病基因?yàn)槿旧w7p15的同源盒基因HOXAl3(HomeoboxA1
6、3，MIM142959)。本文以上述肢端畸形的三個(gè)中國(guó)人家系(SYMl、SHFM和HFGS)為研究對(duì)象，首先利用單體型分析進(jìn)行了致病基因染色體定位，然后對(duì)候選基因DNA測(cè)序或定量PCR進(jìn)行突變鑒定，進(jìn)一步通過(guò)westemblot、雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和染色質(zhì)免疫沉淀等技術(shù)對(duì)突變基因功能進(jìn)行初步研究。材料與方法1、家系資料對(duì)家系中可能追溯到的家庭成員進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，繪制家系系譜圖；簽署“知情同意書”；對(duì)患者進(jìn)行體格檢查和手足骨骼X光檢查；采集外周靜脈血。2、單體型分析定位候選致病基因利用UCSC基因組生
7、物信息學(xué)網(wǎng)站在5個(gè)SHFM位點(diǎn)選擇20對(duì)微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記，PCR擴(kuò)增后經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染，讀出每個(gè)個(gè)體標(biāo)記的基因型。再根據(jù)個(gè)體基因型和系譜中的親緣關(guān)系，按照孟德爾遺傳定律推導(dǎo)出同一條染色體上不同標(biāo)記構(gòu)成的單體型。3、候選基因編碼區(qū)DNA測(cè)序根據(jù)單體型分析確定候選基因后，PCR擴(kuò)增患者候選基因外顯子，PCR產(chǎn)物2純化后測(cè)序。4、定量PCR檢測(cè)基因組拷貝數(shù)變異利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增患者候選基因，與『F常個(gè)體比較其基因組拷貝數(shù)是否發(fā)生改變。5、長(zhǎng)距離PCR結(jié)合DNA測(cè)序確定斷裂點(diǎn)定量PCR將兩側(cè)斷
8、裂點(diǎn)范圍縮小到2-4kb后，以患者基因組DNA為模板，利用端粒側(cè)重復(fù)的正向引物R2．2F及中心粒側(cè)重復(fù)的反向引物L(fēng)10．5R(outfacingprimers)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序。6、構(gòu)建野生型和突變型真核表達(dá)載體PCR擴(kuò)增目的基因GDF5和HOXAl3編碼序列，分別與真核表達(dá)載體pLXSN和p3xFLAG．CMV7連接后轉(zhuǎn)化感受念細(xì)胞，陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證；以野生型載體為模板，定點(diǎn)誘變產(chǎn)生突變型載體。7、West
