資源描述：
《抗人CD40人鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、957281鉚碩士學(xué)位論文(2006屆)抗人CD40人-鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究ConstructionandExpressionofHuman—MouseChimericAntibodyagainstHumanCD40andCharacterizationofItsBiologicalFunction研究生姓名指導(dǎo)教師姓名申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別專業(yè)名稱研究方向論文提交日期瞿秋霞張學(xué)光醫(yī)學(xué)碩士免疫學(xué)分子免疫2006年5月抗人CD40人+鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表選及其生物學(xué)活性的初步研究中文摘要抗入CD40人一鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)及其生物
2、學(xué)活性靜襁步研究攘要本研究在本科窳自行研制成功的國晦首株激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體(5C11)靜萋稿上，菜蓬經(jīng)典扮嵌臺(tái)魏體褐建方法，對(duì)萁進(jìn)行基圓工程改選，并在CHO細(xì)麓中實(shí)現(xiàn)真撥表達(dá)，進(jìn)而對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行初步的研究，以期獲得能持續(xù)商效分泌特舜毪靜抗大CD40入一鬣袋合抗體的穩(wěn)定紹穩(wěn)棟，為籍囪CD40分子的辯瘩免疫治療提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，也期在治療性單抗的研發(fā)領(lǐng)域中取得突破。第一郝分首先采用RT-PcR鼠特異往分泌抗大CD40蘋克隆抗體匏雜交瘸鱺胞株5C11中提取總RIgA，常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄，威用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)重、輕鏈萋閔痔雍分櫥結(jié)果
3、設(shè)計(jì)g
4、物，應(yīng)用SMART-PCR方法擴(kuò)增含信號(hào)膝序列靜vH和vL基因，進(jìn)行測(cè)序鑒定。同時(shí)采用RT-PCR從人脾臟細(xì)胞中抽提總RNA，分別沒計(jì)特異往}}物擴(kuò)增入IgGlgamma鏈huFc、huCHl基因和《appa鏈洹寇區(qū)基西huCx：，并利用TP．PCR方法將huFc和huCHI進(jìn)行拼接得到人IgGlgamma(CHl．CH3)鏈恒定區(qū)基因，測(cè)序鑒定。將含信號(hào)歇亭剿韻VH痔列和入翁IgGl耋鏈恒定囂序列進(jìn)彳亍拼接獲得嵌含重鏈，將含信號(hào)肽序列的VL序列和人的nappa鏈恒定區(qū)序列進(jìn)行拼接獲得嵌合輕鏈，拼接產(chǎn)物測(cè)序鑒定，構(gòu)建共表達(dá)鏇臺(tái)重、輕鏈的燕
5、組質(zhì)粒pIRES／hu5C1l。plRESPau5C11重組質(zhì)獨(dú)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)臌，利用CD40一E929和mock-L929細(xì)胞株，通過流式細(xì)臆術(shù)對(duì)293T細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)上清中抗入CD40入．鼠嵌合抗體進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，本研究成功構(gòu)建了含人．鼠嵌臺(tái)重鏈和嵌合輕鏈基蘺的抗入CD40人．鼠嵌合抗體真核表逸載體plRES／hu5C11。第二部分選擇中國倉鼠卵巢細(xì)膩(CHO)作為表達(dá)宿主，經(jīng)試劑愈描提的plRESfhtu5C11靜}臺(tái)抗體重組褒達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)律法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，獲得持續(xù)穩(wěn)定分泌袋達(dá)抗人elM0人-鼠嵌合抗體(ch-5C11)的基因
6、轉(zhuǎn)染細(xì)胞橡(hu5C11-CH0)。RT-PCR鍪定結(jié)果表鞠ch-5C11表達(dá)摹嗣成功整合在hu5Ctl-CHO細(xì)胞中；FCM軍口Westemblot嬲。；轉(zhuǎn)染pIRES／hu5C11質(zhì)粒的CHO培養(yǎng)上港中舍有抗人CD40人．鼠嵌臺(tái)抗體；i?萁攀霞曝鬻了特異諼涮CD40分子活能，并且宙人免疫球蛋白FcI抗人L-"D40人．鼠嵌合抗體的構(gòu)建，表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究中文摘要段和1c鏈；利用ProteinG親和層析純化細(xì)胞培養(yǎng)上清中嵌合抗體，lowy法濃度檢測(cè)得出抗體產(chǎn)量為O．535mg／L，純化后的抗體經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳鑒定純度良好。第
7、三部分選擇高表達(dá)人CD40分子的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Daudi作為研究對(duì)象，對(duì)CHO基因工程細(xì)胞中表達(dá)的ch-SCll的生物學(xué)活性進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，ch．5Cll能識(shí)別Daudi細(xì)胞表面CD40分子，光鏡下可觀察到該嵌合抗體能介導(dǎo)Daudi細(xì)胞發(fā)生同型聚集，MTT實(shí)驗(yàn)還提示該嵌合抗體能抑制Daudi細(xì)胞增殖。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了抗人CD40人．鼠嵌合抗體(oh．5C11)真核表達(dá)質(zhì)粒，并在CHO中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)的嵌合抗體能有效抑制B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株的增殖。關(guān)鍵詞：CD40，單克隆抗體，嵌合抗體，基因工程，真核細(xì)胞，蛋白質(zhì)表達(dá)，淋巴
8、瘤II碩士生：瞿秋霞指導(dǎo)教師：張學(xué)光教授抗人CD,10人．鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究英文摘要ConstructionandExpressionofHuman—MouseChimericAntibodyagainstHumanCD40andCharacterizationOfItsBiologicalFunctionAbstractCD40isaMr50，000transmembraneproteininthetumornecrosisfactor(TNF)receptorsuperfamily．CD40一CD40ligand(
9、CD40L)interactionsplayacriticalroleintheregulationofh哪oraIandcellula
