免疫膠體金的制備及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

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1、免疫膠體金的制備及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用發(fā)布時(shí)間02年09月06日12時(shí)56分免疫膠體金的制備及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用周友泉綜述(廈門(mén)第一七四醫(yī)院361003)摘要免疫膠體金技術(shù)是四大免疫標(biāo)記技術(shù)之一，問(wèn)世二十多年來(lái)發(fā)展十分迅速，在生物醫(yī)學(xué)各研究領(lǐng)域特別是在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了日益廣泛的應(yīng)用。本文從膠體金技術(shù)的基本原理、制備方法、標(biāo)記技術(shù)和實(shí)際應(yīng)用等幾個(gè)方面對(duì)膠體金技術(shù)作了較系統(tǒng)介紹。1971年Faulk和Taytor將膠體金引人免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

2、主要是免疫層析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogoldfiltrationassayDIGFA)，用于檢測(cè)HBsAg、HCG和抗雙鏈ＤＮＡ抗體等，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。免疫膠體金技術(shù)的基本原理氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固

3、結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中，這一反應(yīng)也可

4、以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱(chēng)之為免疫金銀染色。膠體金的制備方法膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。下面介紹最常用的制備方法及注意事項(xiàng)。１、玻璃容器的清潔：玻璃表面少量的污染會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，一切玻璃容器應(yīng)絕對(duì)清潔，用前經(jīng)過(guò)酸洗、硅化。硅化過(guò)程一般是將玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。專(zhuān)用的清潔器皿以第一次生成的膠體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸餾水淋洗，可代替硅化處理。２、試劑、水質(zhì)和環(huán)境：氯金酸極易吸潮，對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，不能

5、使用金屬藥匙，避免接觸天平稱(chēng)盤(pán)。其１％水溶液在４℃可穩(wěn)定數(shù)月不變。實(shí)驗(yàn)用水一般用雙蒸餾水。實(shí)驗(yàn)室中的塵粒要盡量減少，否則實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將缺乏重復(fù)性。金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測(cè)定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變，應(yīng)選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng)，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH3～5.8)、Tris-HCL(pH5.8～8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5～10.3)等緩沖系統(tǒng)。但應(yīng)注意不應(yīng)使緩沖液濃度過(guò)高而使金溶膠自凝。３、檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠：取0.01％氯金酸水溶液100ml加熱至沸，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入１％

6、檸檬酸三鈉水溶液0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在２分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸１５分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，如此制備的金溶膠其可見(jiàn)光區(qū)最高吸收峰在535nm，Ａ1cm/535=1.12。金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顯著的顏色變化，這就是金溶膠用于免疫沉淀或稱(chēng)免疫凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)。金溶膠顆粒的直徑和制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉量是密切相關(guān)的，保持其他條件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒徑的金溶膠，見(jiàn)附表。附表100ml氯金酸中檸

7、檬酸三鈉的加入量對(duì)金溶膠粒徑的影響１％檸檬酸三鈉ml0.300.450.701.001.502.00金溶膠顏色藍(lán)灰、紫灰、紫紅、紅、橙紅、橙吸收峰(nm)220240535525522518徑粒(nm)14797.571.54124.515４、檸檬酸三鈉－鞣酸混合還原劑：用此混合還原劑可以得到比較滿(mǎn)意的金溶膠，操作方法如下：取4ml１％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H2O)，加入0～5ml１％鞣酸，0～5ml25mmo/LK2CO2（體積與鞣酸加入量相等），以雙蒸餾水補(bǔ)至溶液最終體積為20ml，加熱至60℃取1ml１％的HAuC

8、l4，加于79ml雙蒸餾水中，水浴加熱至60℃，然后迅速將上述檸檬酸－鞣酸溶液加入，于此溫度下保持一定時(shí)間，待溶液顏色變成深紅色(約需0.5～1小時(shí))后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰５分鐘即可。改變鞣酸的加入量，制得的膠體顆粒大小不同。