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1、免疫膠體金的制備及其在醫(yī)學檢驗中的應用膠體金是一種常用的標記技術，有其獨特的優(yōu)點。近年已在各種生物學研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術幾乎都使用其標記。同時在流式、電鏡、免疫、分子生物學以至生物芯片中都可能例用到?！?971年Faulk和Taytor將膠體金引人免疫化學，此后免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法，在生物醫(yī)學各領域得到了日益廣泛的應用。目前在醫(yī)學檢驗中的應用主要是免疫層析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogoldfiltrationassayDIGFA)，用于
2、檢測HBsAg、HCG和抗雙鏈ＤＮＡ抗體等，具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點。免疫膠體金技術的基本原理氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、
3、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具?！ ∶庖呓饦擞浖夹g(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。膠體金的制備方法 膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。下面
4、介紹最常用的制備方法及注意事項。 ?。?、玻璃容器的清潔：玻璃表面少量的污染會干擾膠體金顆粒的生成，一切玻璃容器應絕對清潔，用前經(jīng)過酸洗、硅化。硅化過程一般是將玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。專用的清潔器皿以第一次生成的膠體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸餾水淋洗，可代替硅化處理?！ 。?、試劑、水質(zhì)和環(huán)境：氯金酸極易吸潮，對金屬有強烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其１％水溶液在４℃可穩(wěn)定數(shù)月不變。實驗用水一般用雙蒸餾水。實驗室中的塵粒要盡量減少，否則實驗的結果將缺乏重復性?！?/p>
5、 金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變，應選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng)，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH3～5.8)、Tris-HCL(pH5.8～8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5～10.3)等緩沖系統(tǒng)。但應注意不應使緩沖液濃度過高而使金溶膠自凝?！ 。?、檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠： 取0.01％氯金酸水溶液100ml加熱至沸，攪動下準確加入１％檸檬酸三鈉水溶液0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在２分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸１５分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復到原體積，如此制備的金溶膠其可
6、見光區(qū)最高吸收峰在535nm，Ａ1cm/535=1.12。金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見的顯著的顏色變化，這就是金溶膠用于免疫沉淀或稱免疫凝集試驗的基礎?！ 〗鹑苣z顆粒的直徑和制備時加入的檸檬酸三鈉量是密切相關的，保持其他條件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒徑的金溶膠，見附表。附表100ml氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響１％檸檬酸三鈉ml0.300.450.701.001.502.00金溶膠顏色藍灰紫灰紫紅紅橙紅橙吸收
7、峰(nm)220240535525522518徑粒(nm)14797.571.54124.515 ４、檸檬酸三鈉－鞣酸混合還原劑：用此混合還原劑可以得到比較滿意的金溶膠，操作方法如下：取4ml１％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H2O)，加入0～5ml１％鞣酸，0～5ml25mmo/LK2CO2（體積與鞣酸加入量相等），以雙蒸餾水補至溶液最終體積為20ml，加熱至60℃取1ml１％的HAuCl4，加于79ml雙蒸餾水中，水浴加熱至60℃，然后迅速將上述檸檬酸－鞣酸溶液加入，于此溫度下保持一定時間，待溶液顏色變成深紅色(約需0.5～
8、1小時)后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰５分鐘即可。改變鞣酸的加入量，制得的膠體顆粒大小不同。 ?。?、白磷還原法：在120ml雙蒸餾水中加入1.5ml１％氯金酸和1.4ml0.1mol/LK2CO3，然后加入1ml五分之一
