real time PCRTaqman探針設(shè)計(jì)、實(shí)時多重PCR探針的選擇、引物的設(shè)計(jì)及評價(jià)

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1、realtimePCRTaqman探針設(shè)計(jì)、實(shí)時多重PCR探針的選擇、引物的設(shè)計(jì)及評價(jià)?一、實(shí)時熒光Taqman探針設(shè)計(jì)總原則:探針選擇要保守,引物選擇要保守,因此必須找一段100-200bp相對要保守的片段來設(shè)計(jì)引物與探針。即real-timePCR的擴(kuò)增片段是50bp----150bp。當(dāng)找不到150bp的保守片段時,必須確保探針的片段是保守的。在設(shè)計(jì)探針和引物時,要同時考慮在兩條鏈上設(shè)計(jì)引物與探針。但要注意的是:在那條鏈上設(shè)計(jì)探針時,就應(yīng)靠近在同一條鏈上設(shè)計(jì)的引物(即上游引物)。這樣,可保證在將來擴(kuò)增時,即便沒有完全擴(kuò)增,也有熒光信號報(bào)告出來。兩

2、者的距離最好是探針的5’端離上游引物的3’有一個堿基,但也可以重疊。若在原序列中找不到合適的探針與引物(1主要是探針和上游引物的距離太遠(yuǎn),而離下游引物的距離卻較近時;2突變位點(diǎn)要求在探針的5’端也能檢測到熒光信號,但卻是在3’端),可在互補(bǔ)的序列中設(shè)計(jì)引物與探針。另real-timePCR中的探針和引物的Tm值,均要高于平常PCR的引物和雜交的探針的Tm值。二、探針的設(shè)計(jì)探針設(shè)計(jì)的基本原則:1.保守:探針要絕對的保守,有時分型就單獨(dú)依靠探針來決定。理論上有一個堿基不配對,就可能檢測不出來。若找不到完全保守的片段,也只能選取有一個堿基不同的片段。且這個不

3、同的堿基最好在探針的中間,對探針與目的片段的雜交影響不大,不相同的堿基最好不要在兩端,因?yàn)閮啥瞬焕谔结樀碾s交。且最好為A或T,而不能為G或A,因?yàn)锳、T為雙鍵,而G、A為三鍵。2.探針長度7Taqman探針的長度最好在25-32bp之間,且Tm值在68-72℃之間,最好為70℃,確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出10℃,這樣可保證探針在煺火時先于引物與目的片段結(jié)合。因此探針最好是富含GC的保守片段,保證其的Tm值較高。現(xiàn)在有TaqmanMGB探針,在TAMER之后再標(biāo)記一個MGB,可使探針的Tm值較高,即使探針片段較短,也可達(dá)到Taqman探針的T

4、m值要求(68-70℃)。3.探針的名稱應(yīng)標(biāo)記探針在基因組的位置及長度。4.探針Tm值計(jì)算用oligo或primerpreiemer軟件即可計(jì)算Tm值。確保探針中GC含量在30-80%。應(yīng)避免探針中多個重復(fù)的堿基出現(xiàn),尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現(xiàn)。5.探針的評價(jià)用DNAstar軟件中的Primerselect軟件,點(diǎn)擊“l(fā)og”菜單中的“createprimercatalog”,在“name”中輸入探針的名稱、位置,按Tab鍵進(jìn)入“sequence”,粘貼或輸入要分析的探針序列。選中整個序列后,在“report”菜單下“primerselfd

5、imer”,分析探針的二聚體。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個dimer,并對此探針用dG值進(jìn)行評價(jià)(通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好)。在“report”菜單下“primerhairpins”,分析探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個hairpins,并對此探針的hairpins進(jìn)行評價(jià)。多重?zé)晒釶CR時,要對多條探針進(jìn)行“pairdimer”進(jìn)行分析。6.探針的5’端不能為G因?yàn)榧词箚蝹€G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)相連時,G可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號,從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。7.Taqman探針與引物之間的位置7Taqm

6、an探針應(yīng)靠近上游引物,即Taqman探針應(yīng)靠近與其在同一條鏈上的上游引物。兩者的距離最好是探針的5’端離上游引物的3’有一個堿基,但也可以重疊,要保證Taqman探針的5’端離上游引物的5’端至少有4bp。如:?forwardprimerTaqmanprobe  5’→3’5’FAM→3’染料  NNNNNNNNNNNNNN  發(fā)表序列:5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’  互補(bǔ)發(fā)表序列3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’  NNNNNNN  3’←5’  re

7、verseprimer  或:  reverseprimer  5’→3’  NNNNNNN  發(fā)表序列:5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’  互補(bǔ)發(fā)表序列3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’  NNNNNNNNNNNNNN  料染3’←MAF5’3’←5’  Taqmanprobeforwardprimer  Taqmanprobeforwardprimer然后探針用同一染料標(biāo)記,這樣在實(shí)時PCR反應(yīng)中,雖然是多重PCR反應(yīng),但報(bào)告卻是同一個染料報(bào)告。三引物的設(shè)

8、計(jì)71.上下游引物要保守為了能夠擴(kuò)增出所需要的保守片段,必須對保守的100-200片段進(jìn)行PC

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