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《化學(xué)發(fā)光法測(cè)定SOD活性的干擾因素及消除方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、第18卷第4期分析科學(xué)學(xué)報(bào)2002年8月Vol.18No.4JOURNALOFANALYTICALSCIENCEAug.2002文章編號(hào):100626144(2002)0420321203化學(xué)發(fā)光法測(cè)定SOD活性的干擾因素及消除方法徐靖趙蘭華宋功武(鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室,湖北十堰,442000)(湖北大學(xué)分析測(cè)試中心,武漢,430062)摘要:采用黃嘌呤2黃嘌呤氧化酶及鄰苯三酚自氧化作為酶和非酶超氧陰離子自由基發(fā)生體系,以魯米諾為發(fā)光劑,通過(guò)SOD對(duì)發(fā)光的抑制率以測(cè)定SOD活性。采用加熱樣品使SOD失活,測(cè)得樣品發(fā)光抑制率本底值,扣除本底值以消除干擾。在兩種體
2、系中測(cè)得結(jié)果有高度一致性,樣品中SOD活性分別為170±9.3U?mL和165±210U?mL。本法用于測(cè)定生物制劑中SOD活性,不需有機(jī)溶劑萃取,可有效地消除干擾,是一種實(shí)用、可靠測(cè)定SOD活性的方法。關(guān)鍵詞:超氧化物歧化酶;化學(xué)發(fā)光;黃酮類;抗壞血酸;超氧陰離子中圖分類號(hào):O657.39;Q55文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A[1]超氧化物歧化酶(SOD,EC1.15.1.1)是一種存在于需氧生物體內(nèi)的金屬酶。它能特異地催化超·-氧陰離子自由基(O2)的自發(fā)歧化,因此,被認(rèn)為具有防御活性氧毒性、預(yù)防衰老及防治腫瘤和炎癥等[2,3]功能?；瘜W(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、專一性好、測(cè)定
3、快速等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于測(cè)定各種生物樣品中的[1,4,5]·-SOD活性。但是由于各種酶或非酶體系所產(chǎn)生的O2不僅能被SOD所消除,同時(shí)也能被黃酮類化[6,7]合物和濃度較高的維生素C、E等消除。因此,在測(cè)定含這些物質(zhì)濃度較大的植物及生物制劑樣品時(shí),往往受到很強(qiáng)的干擾。用萃取法處理操作繁雜、費(fèi)時(shí),有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染。因此,有必要尋求更為方便有效地消除干擾方法。·-[4][5]本文報(bào)道用兩種不同的O2發(fā)生體系(黃嘌呤2黃嘌呤氧化酶體系和鄰苯三酚自氧化體系)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)保健飲品三勒漿口服液中SOD活性,探討了干擾因素及消除方法。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑LKB
4、1250型發(fā)光光度計(jì)(Wallac,Finland)用于發(fā)光強(qiáng)度測(cè)定。魯米諾(Sigma公司,L)用0.1mol?LNa2CO3溶解后配成1mmol?L水溶液待用;黃嘌呤(三級(jí)純,上海東風(fēng)制藥廠,X)臨用前以0.05mol?LpH10.20Na2CO32NaHCO3緩沖溶液新鮮配制,并與魯米諾混合成0.1mmol?L的X2L混合液;黃嘌呤氧化酶(XOD,華東師范大學(xué)生物系提供,60%(NH4)2SO4懸浮液,活力5U?mL),臨用前以4℃預(yù)冷的0.05mol?LpH7.8的K2HPO42KH2PO4緩沖溶液稀釋至0.1U?mL;鄰苯三酚(AR級(jí),遵義市第二化工
5、廠,P),以1mmol?LHCl配成0.01mol?L溶液,4℃保-4存,臨用前以重蒸水稀釋至3.13×10mol?L;0.05mol?LpH10.20Na2CO32NaHCO3緩沖溶液(含011mmol?LEDTA,簡(jiǎn)寫為CB)用前現(xiàn)配,以pH計(jì)較準(zhǔn)pH值至10.20,用于配制鄰苯三酚2魯米諾體系時(shí)與1mmol?L魯米諾以2∶1(V∶V)混合成L2CB混合液?？箟难?AR級(jí),Vc,上海前進(jìn)試劑廠)以雙蒸水配制成0.05mol?L儲(chǔ)備液,避光保存;槲皮素(QC)和蕓香甙(RT)單體均由四川大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供;SOD標(biāo)準(zhǔn)品:300000U?mL,由四川大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥
6、理學(xué)教研室提供,用鄰苯三酚自氧化比色法測(cè)定,臨用前以0.05mol?LpH7.8的磷酸鉀緩沖溶液(含0.1mmol?LEDTA)稀釋至一定濃度。收稿日期:2001206214通訊聯(lián)系人:徐靖123第4期徐靖等:化學(xué)發(fā)光法測(cè)定SOD活性的干擾因素及消除方法第18卷1.2樣品三勒漿口服液(四川華美制藥有限公司,標(biāo)示SOD活力>3600U?30mL,維生素C>108mg?30mL,購(gòu)于成都市德仁堂藥店)。1.3實(shí)驗(yàn)方法[4]1.3.1化學(xué)發(fā)光體系及發(fā)光測(cè)量X2XOD2L體系測(cè)定方法參照文獻(xiàn)。P2L體系測(cè)定方法參照文[5]獻(xiàn)。1.3.2SOD活力測(cè)定將SOD用0.05
7、mol?LpH7.8的磷酸鹽緩沖溶液配制成不同濃度的酶溶液,樣品在4℃,10000r?min下離心,取上清液,用同一緩沖溶液稀釋500倍待測(cè)。以空白的發(fā)光強(qiáng)度為100%,計(jì)算加入SOD后抑制發(fā)光的百分?jǐn)?shù),以此對(duì)SOD濃度(本文中為單位活力)作圖。樣品SOD單位活力可直接以標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得值乘以稀釋倍數(shù),即:單位活力(U?mL)=查得值×500×1000?10。1.3.3干擾及消除抗壞血酸、蕓香甙、槲皮素對(duì)兩種體系發(fā)光的抑制:以測(cè)定SOD活力相同的條件和方法,測(cè)定抗壞血酸、蕓香甙、槲皮素對(duì)兩種體系發(fā)光的抑制率,以研究干擾情況。標(biāo)準(zhǔn)品SOD加熱失活條件試驗(yàn):分別在兩
8、種體系中測(cè)定不同加熱溫度下,使SOD完
