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1、鄰苯三酚自氧化法測定sod活性及含量一、實(shí)驗原理:???鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物，中間物的積累在滯留30～45s后，與時間成線性關(guān)系，一般線性時間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長處有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過測定光吸收即可求出SOD的酶活性。二、實(shí)驗試劑：這個液體貌似是不能研磨的，而且本身就是酶，正常的生物體內(nèi)的酶不都是可溶的？研磨是為了破碎細(xì)胞的。我覺得應(yīng)該是通過加水——打碎膠體，把抗氧化劑全
2、都搞到水中（這個拜托查下）——分液——乙醇-氯仿沉淀（用來鑒別是帶Mn還是CuZn）（不知道會不會有另外兩種抗氧化劑干擾）——透析（去離子電泳用）乙醇-氯仿的濃度比酶的保存問題：測一下大寶pH應(yīng)該可以作為參考，但是這個酶種類太多了，要點(diǎn)就是pH至少不能小于6，關(guān)于最適合pH是否也要測量？還是說我們是為了測量大寶里面SOD的活性所以就按照大寶的pH保存。還有一個小小的想法就是。這部分是1次做完還是兩次做完？大寶sod蜜、冷丙酮、磷酸緩沖液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、鄰苯三酚、濃鹽酸、天平、石英砂、研缽、冷凍離心機(jī)、
3、50mL離心管8個、紫外-可見分光光度計、250mL三角瓶8個、玻璃棒8根、試劑瓶250mL3個、500mL3個、250mL燒杯16個、試管帶膠塞80根、移液管各5根成分：水，礦油（保濕），甘油（保濕），鯨蠟硬脂醇（稠化劑），聚二甲基硅氧烷（硅油），油，無視。月桂醇磷酸酯鉀降低pH變成油，超氧岐化酶（SOD，抗氧化劑），人參根提取物（抗氧化劑），膜莢黃芪根提取物（抗氧化），甘油硬脂酸酯（稠化劑）油，EDTA二鈉（螯合劑）干擾劑，香精，羥苯甲酯（防腐劑）微溶于水，羥苯丙酯（防腐劑）不溶于水，DMDM乙內(nèi)酰脲（防腐劑）。含量0.1～0.6％E
4、DTA二鈉：幾乎不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值約為5.3。用于絡(luò)合金屬離子和分離金屬。干擾物，但是沒有氧化性三、實(shí)驗步驟：（1）SOD提?。喝〈髮歴od蜜加入15mL的PH7.80.05mol/L的磷酸緩沖液，研磨攪拌20分鐘，使SOD充分溶解，6000rpm離心，棄去沉淀，得上清液。(留出1mL備用，準(zhǔn)確量取剩余上清液體積，記錄)（2）除雜蛋白：提取液加入1/4體積的氯仿-乙醇混合液攪拌10min，6000rpm離心15min去沉淀，得粗酶液。（取1mL粗酶液備用,精確測量剩余粗酶液體積）（3）SOD酶的沉淀分離：??剩余的粗酶液中加
5、入等體積的冷丙酮，攪拌15min，6000rpm離心15min，得到SOD酶沉淀。將沉淀先加2mL磷酸緩沖液，溶解后再加3mL混勻。6000rpm離心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL備用，其余量取體積。（4）粗酶液活性測定：提取液、粗酶液、酶液中SOD活力檢測，具體步驟如下。加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計時4min，加一滴濃鹽酸停止反應(yīng)，420nm測吸光值。試劑/（mL）空白管對照管OD1提取液OD2粗酶液OD2酶液OD2PH8.3緩沖液33333樣品000.10.10.1蒸餾水21.81.71.71.7室溫放置20min鄰苯三
6、酚00.20.20.20.2（5）溶液中可溶性蛋白含量測定：?分別從1mL備用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍數(shù)稀釋，260nm/280nm測定吸光值，按公式計算蛋白質(zhì)濃度。提取液稀釋：50×粗酶液稀釋：20×酶液稀釋：10×四、實(shí)驗數(shù)據(jù)：???提取液粗酶液酶液總體積（ml）????對照管（OD1）提取液（OD2）粗酶液（OD2）酶液（OD2）420nm吸光值?????提取液粗酶液酶液260nm吸光度值???280nm吸光度值???公式蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=(1.45A280－0.74A260)×稀釋倍數(shù)蛋白質(zhì)濃度（mg/
7、ml）???五、實(shí)驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理：（1）酶活力單位提取液酶活力單位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=粗酶液活力單位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=酶液活力單位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=（2）總活力提取液總活力U=活力單位×總體積=粗酶液總活力=活力單位×總體積=酶液總活力=活力單位×總體積=（3）比活力提取液酶液比活力U/mg=活力單位/蛋白質(zhì)濃度=粗酶液比活力U/mg=活力單位/蛋白質(zhì)濃度=酶液比活力U/mg=活力單位/蛋白質(zhì)濃度=（4）純化倍數(shù)粗酶液純化倍數(shù)=粗酶液比活力/提取液比活力=酶液純化倍數(shù)=酶液比活力
8、/提取液比活力=（5）回收率粗酶液回收率=粗酶液總活力/提取液總活力=酶液回收率=酶液總活力/提取液總活力=
