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《氮藍(lán)四唑(nbt)法測(cè)定超氧化物歧化酶(sod)活性》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)三氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理。2、掌握氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來(lái)確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)
2、色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除超氧陰離子自由基，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。三、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料水稻或小麥等植物葉片。（二）儀器設(shè)備高速臺(tái)式離心機(jī)，分光光度計(jì)，微量進(jìn)樣器，熒光燈（反應(yīng)試管處照度為4000Lx），試管或指形管數(shù)支。（三）試劑（1）0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）。91.5ml0.05MNa2HPO4+8.5ml0.05MNaH2PO4。（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至10
3、0ml。（3）750μmol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。20（4）100μmol/LEDTA-Na2溶液：稱取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸緩沖液定容至1000ml。（5）20μmol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml，避光保存。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、酶液提取取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.52g于預(yù)冷的研缽中，加1ml預(yù)冷的磷酸緩液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為4ml。取4ml于4℃10000r/min離心20min上清液即為SOD粗提液。2、顯色反應(yīng)取10mL試
4、管（要求透明度好）4支，2支為測(cè)定管，另2支為對(duì)照管，按下表加入各種溶液：各溶液顯色反應(yīng)用量混勻后將1支對(duì)照管置暗處，其他各管于4000lx日光下反應(yīng)20min（要各管受光情況一致，溫度高，時(shí)間縮短，低時(shí)延長(zhǎng)）。3、SOD活性測(cè)定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，全部移入暗處，以不照光的對(duì)照管作空白，分別測(cè)定其他各管的吸光度。注意：用放在暗處的緩沖液代替酶液的空白管調(diào)零，各試劑按比例混合好（3.5ml緩沖液+0.5ml甲硫氨酸+0.5ml氮藍(lán)四唑+0.5mlEDTANa2+0.40ml蒸餾水），再加100ul酶液，核黃素0.5ml最后單獨(dú)加入?？傮w積6.0mL表10SOD活性測(cè)定的試劑量
5、試管編號(hào)1對(duì)照（不光照）2對(duì)照（光照）34緩沖液（mL）3.503.503.503.50甲硫氨酸（mL）0.500.500.500.50氮藍(lán)四唑（mL）0.500.500.500.5020EDTANa2（mL）0.500.500.500.50蒸餾水（mL）0.500.500.400.40酶液000.100.10核黃素0.500.500.500.50測(cè)定結(jié)果0AckAE1AE2表11SOD活性測(cè)定（平行測(cè)定2次）的Abs試管號(hào)2對(duì)照（光照）34平行測(cè)定次數(shù)第一次第二次第一次第二次第一次第二次吸光度A（Abs）0.2030.2510.0550.1990.0350.140五、結(jié)果
6、計(jì)算計(jì)算公式：SOD（U/g.FW）=(Ack-AE)*VT/Ack/0.5/W/Vs式中VT-總酶液量（ml）Vs-所用酶液量（50ul）W-葉片鮮重（g）Ack-用緩沖液代替酶液的照光對(duì)照管吸光度AE-樣品管吸光度表12SOD活性的計(jì)算VT=400uLVs=50uLW=0.52g平行側(cè)定次數(shù)第一次第二次樣品管管號(hào)3434SOD（U/g.FW）0.2240.2550.0640.136六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析討論20總黃酮生物總黃酮是指黃酮類(lèi)化合物，是一大類(lèi)天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見(jiàn)的是黃酮和黃酮醇，其它包括雙氫黃（醇）、異黃酮、雙黃酮、黃
7、烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類(lèi)等。簡(jiǎn)介 近年來(lái)，由于自由基生命科學(xué)的進(jìn)展，使具有很強(qiáng)的抗氧化和消除自由基作用的類(lèi)黃酮受到空前的重視。類(lèi)黃酮參與了磷酸與花生四烯酸的代謝、蛋白質(zhì)的磷酸化、鈣離子的轉(zhuǎn)移、自由基的清除、抗氧化活力的增強(qiáng)、氧化還原作用、螯合作用和基因的表達(dá)。它們對(duì)健康的好處有：（1）抗炎癥（2）抗過(guò)敏（3）抑制細(xì)菌（4）抑制寄生蟲(chóng)（5）抑制病毒（6）防治肝病（7）防治血管疾?。?）防治血管栓塞（9）防治心與腦血管疾病（10）抗腫瘤（11）抗化學(xué)毒物等。天然來(lái)源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能
