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《4氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活力.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、個(gè)人收集整理僅供參考學(xué)習(xí)氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除超氧陰離子自由基，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出
2、酶活性大小。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：植物葉片。（二）儀器設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，分光光度計(jì)，微量進(jìn)樣器，熒光燈（反應(yīng)試管處照度為4000lx），試管或指形管數(shù)支，黑色硬紙?zhí)?。（三）試劑?）0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）。[0.2M的Na2HPO491.5mL和NaH2PO48.5mL混合后稀釋4倍]or[0.05mol/LPBS緩沖液（pH7.8）：7.1g/L，6.8g/LKH2PO4，按體積9:1混合，如pH高或低于7.8，則用KH2PO4或Na2HPO4調(diào)節(jié)。每1000mL緩沖液含8gNaCl，0.2gKCl]提取介質(zhì)：內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述緩沖液。
3、（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml。（3）750μmol/L氮藍(lán)四唑溶液（NBT）：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。（4）100μmol/LEDTA-Na2溶液：稱取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸緩沖液定容至1000ml。（5）20μmol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.酶液提取取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于研缽中液氮研磨成粉末，加2ml預(yù)冷的提取介質(zhì)在冰浴上研磨成漿，加入提取介質(zhì)沖洗研缽
4、，提取介質(zhì)終體積為5ml。取1.5-2ml于4℃下10000r/min下離心20min，上清液即為SOD粗提液。2.顯色反應(yīng)取5ml指形管或試管（要求透明度好）4支，2支為測(cè)定管，另2支為對(duì)照管，按下表加入各種溶液：[當(dāng)樣品數(shù)量較大時(shí)，可在臨用前根據(jù)用量將表中各試劑（酶和核黃素除外）按比例混合后每支試管一次加入2.65mL，然后依次加入核黃素和酶液，但終濃度不變。]試劑名稱用量（mL）終濃度（比色時(shí)）0.05mol/L磷酸緩沖液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA-Na2溶液0.310μmo
5、l/L20μmol/L核黃素溶液0.32.0μmol/L酶液0.052支對(duì)照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.25總體積3.0混勻后將1支對(duì)照管罩上比試管稍長的雙層黑色硬紙?zhí)渍诠饣騻€(gè)人收集整理僅供參考學(xué)習(xí)置暗處，其他各管于4000lx日光下反應(yīng)10min（要求各管受光情況一致，反應(yīng)溫度控制在25～35℃之間，溫度高時(shí)間縮短，低時(shí)延長；視酶活性高低可適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間）。3.SOD活性測(cè)定至反應(yīng)結(jié)束后，用黑布罩蓋上試管，以不照光的對(duì)照管作空白，分別測(cè)定其他各管在560nm下的吸光度。四、結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50％為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。式中：SOD
6、——活性以每克鮮重酶單位表示，比活力以每毫克蛋白酶單位表示；A0——照光對(duì)照管的吸光值；As——樣品管的吸光值；Vt——樣液總體積（mL）；VS——測(cè)定時(shí)樣品用量（mL）；W——樣品鮮重（g）；蛋白質(zhì)濃度——每克鮮重含蛋白毫克數(shù)（mg·g-1）。五、注意事項(xiàng)1.核黃素產(chǎn)生O2-，NBT還原為藍(lán)色的化合物都與光密切相關(guān)，因此，測(cè)定時(shí)要嚴(yán)格控制光照的強(qiáng)度和時(shí)間。2.植物中的酚類對(duì)測(cè)定有干擾，制備粗酶液時(shí)可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP），盡可能除去植物組織中的酚類等次生代謝物質(zhì)。3.測(cè)定SOD活性時(shí)加入的酶量，以能抑制反應(yīng)的50％為佳。
