RT-PCR中引物的選擇指南

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1、RT-PCR中引物的選擇指南一.用于RT-PCR的引物1.特異性引物（跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物）2.隨機(jī)引物（Randomprimer）3.oligo(dT)引物二.反轉(zhuǎn)錄酶M-MULV和AMV三.常用內(nèi)參引物的參考序列一．用于RT-PCR的引物一般做RT-PCR進(jìn)行第一鏈cDNA合成的起始可以使用特異性引物、隨機(jī)引物（Randomprimer）、oligo(dT)三種不同的方法，各種方法的相對(duì)特異性影響了所合成cDNA的量、種類(lèi)及效果（如表一）。1.特異性引物（跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物）對(duì)于RT-PCR，引物設(shè)計(jì)質(zhì)量影響RT的結(jié)果，而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，

2、所以第一鏈cDNA合成不推薦使用。但是如果以RNA為模板進(jìn)行一步法檢測(cè)基因表達(dá)情況，一般建議添加特異性引物，這樣設(shè)計(jì)的主要目的是消除RT-PCR時(shí)基因組DNA污染對(duì)結(jié)果的影響。跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物有兩種做法（如下圖A和B）：1.1在兩個(gè)不同的外顯子上設(shè)計(jì)引物，上下引物分別位于不同的外顯子上這樣從和cDNA和基因組DNA中擴(kuò)增的片段大小不同(基因組DNA中的包含內(nèi)含子擴(kuò)增的要大些)，從而可以通過(guò)用合適的延伸時(shí)間來(lái)限制基因組中大片段的擴(kuò)增，消除基因組DNA污染的影響(這要求跨越的內(nèi)含子要大些)。1.2上游或者下游引物或者兩者，引物本身在兩個(gè)不同的外顯子上注意引

3、物在兩個(gè)外顯子上分布，在“內(nèi)側(cè)”要少些，少于8bp左右。這樣的引物就不能從基因組DNA擴(kuò)增，從而消除基因組DNA污染的影響(這要求目的基因具有較多的外顯子，從而有較多的選擇，引物本身質(zhì)量可能不好。2.隨機(jī)引物（Randomprimer）在兩步法RT-PCR中，mRNA必須先轉(zhuǎn)錄為cDNA。在這種情況下，采用不依賴序列的引物，例如隨機(jī)引物和oligo(dT)引物。隨機(jī)引物，一般指的是多個(gè)任意的堿基連接而成的一套寡聚引物組，常見(jiàn)的是random（6），random6（9），random（10），如果6個(gè)堿基的隨機(jī)序列，則是5’-d（NNNNNN）-3’，共

4、有4條引物。原核生物由于沒(méi)有poly(A)，因此在進(jìn)行總mRNA的RT時(shí)要用到隨機(jī)引物，由于其比較短小，且隨機(jī)組合豐富，所以在mRNA上的結(jié)合也很多，產(chǎn)生短的，部分長(zhǎng)度的cDNA，因此也可以進(jìn)行有效的RT。這種方法經(jīng)常用于獲取5’末端序列及從帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的RNA模板獲得cDNA。因此一般適用于長(zhǎng)的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA；適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有單一模板RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在RT-PCR用隨機(jī)引物制備CDNA時(shí)，要去除總RNA中的tRNA、rRNA，只保留mRNA。因?yàn)轶w系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cD

5、NA第一鏈模板，所以隨機(jī)引物法是三種方法中特異性最低的，通常用此引物合成的cDNA中96%來(lái)源于rRNA。所以隨機(jī)引物介導(dǎo)制備的cDNA產(chǎn)物復(fù)雜程度高，從而降低了后續(xù)PCR反應(yīng)的敏感度和特異性。為了獲得最長(zhǎng)的cDNA，需要按經(jīng)驗(yàn)確定每個(gè)RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應(yīng)體系。2.1隨機(jī)引物優(yōu)先應(yīng)用范圍：üRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，合成帶有或不帶有poly（A）的cDNA。ü長(zhǎng)片斷的mRNA5’—區(qū)域的RT–PCR。ü模板RNA具有較多二級(jí)結(jié)構(gòu)的CDNA的合成。ü可用于Northern/Southern雜交、

6、原位雜交和克?。删唠s交的標(biāo)記探針。mRNA差異顯示。ü病毒鑒定，因?yàn)榇蠖鄶?shù)病毒的序列是未知的，所以在RNA病毒的研究中一般用隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行鑒定。3.oligo(dT)引物：Oligo(dT)一般指的是多個(gè)T堿基連接而成的寡聚引物，主要是針對(duì)真核生物具有Poly(A)尾時(shí)設(shè)計(jì)的用于RT，因此RT-PCROligo(dT)起始比隨機(jī)引物特異性高。因?yàn)閜oly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，因此之前必須先把poly(A)+RNA提取出來(lái)。所以與使用隨機(jī)引物相比，cDNA的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因?yàn)槠漭^高的特異性，oligo(dT)一般不

7、需要對(duì)RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每20μl反應(yīng)體系使用0.5μgoligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數(shù)RT-PCR。3.1oligo(dT)適應(yīng)范圍：Oligo(dT)針對(duì)真核生物具有Poly(A)尾設(shè)計(jì)，所以特異性好，但是同時(shí)對(duì)RNA樣品要求較高，是生成全長(zhǎng)cDNA的大多數(shù)兩步RT-PCR應(yīng)用中較受歡迎的引物延伸法。原因是許多逆轉(zhuǎn)錄酶不能高效地將全長(zhǎng)mRNA序列轉(zhuǎn)錄到5’端。但是即使有少量降解也會(huì)使全長(zhǎng)cDNA合成量大大減少。因此對(duì)于較長(zhǎng)的mRNA，或是因?yàn)镽NA中間可能具有的二級(jí)結(jié)構(gòu)等往往使得反轉(zhuǎn)錄反

8、應(yīng)提前終止，也導(dǎo)致不能達(dá)到mRNA的5’末端，就是擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有限，這一方面和RNA完整性和