蔗糖酶的制備和活力測(cè)定

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1、蔗糖酶的制備和比活力的測(cè)定酵母蔗糖酶的制備各級(jí)分酶溶液活性的測(cè)定（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（2）蔗糖酶水解蔗糖后還原糖含量的測(cè)定3.各級(jí)分蔗糖酶溶液蛋白質(zhì)含量的測(cè)定4.各級(jí)分蔗糖酶溶液比活力的計(jì)算實(shí)驗(yàn)內(nèi)容比色法測(cè)酶活性的原理酶活力單位（U）：在特定條件下反應(yīng)1min,每產(chǎn)生1mmol底物所需要的酶量，或轉(zhuǎn)化底物中1mmol的有關(guān)基團(tuán)的酶量。實(shí)際應(yīng)用是1ml酶液所產(chǎn)生底物的量定為1ml酶液的活力酶的比活力:每mg酶蛋白質(zhì)所具有的酶活力在蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖,最適pH值為3.5-

2、5.5。通過測(cè)定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測(cè)定蔗糖酶的活力，同時(shí)測(cè)定蛋白含量，從而求得酶的比活力。制備蔗糖酶(冰上操作！)研磨水抽提（級(jí)分I）機(jī)械破碎，提取水溶性蛋白成分（留出1.5ml測(cè)酶活力和蛋白質(zhì)含量，余做下一步）熱抽提（級(jí)分II）：去除部分熱變性蛋白雜質(zhì)（留出1.5ml測(cè)酶活力和蛋白質(zhì)含量，余做下一步）乙醇抽提（級(jí)分III）：有機(jī)溶劑沉淀濃縮蔗糖酶等量分裝在兩個(gè)1.5ml的EP管中，4℃保存，做為下兩次實(shí)驗(yàn)中的酶酶分離提純的總目標(biāo)是提高回收率及純度，保持較高的酶比活力（低溫操作）研

3、磨水抽提（級(jí)分I）將研缽放入冰中，預(yù)冷去離子水稱10g酵母和約5g二氧化硅，放入研缽中緩慢加入預(yù)冷的去離子水30ml，每次加2ml，邊加邊研磨；研磨30分鐘以上，直至酵母細(xì)胞大部分研碎將混合物轉(zhuǎn)入兩個(gè)離心管中，平衡，4度10000rpm離心15min用滴管將上清水相轉(zhuǎn)入另一個(gè)清潔離心管中，再次離心15min上清轉(zhuǎn)入量筒測(cè)體積，用1M乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.0留出1.5ml測(cè)酶活力和蛋白質(zhì)含量（冰上），余做下一步熱抽提（級(jí)分II）將級(jí)分I水浴50度30分鐘，不斷輕搖此時(shí)可以開始做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線冰浴迅速

4、冷卻3-5分鐘，4度10000rpm離心15min將上清轉(zhuǎn)入小燒杯，置于冰上留出1.5ml測(cè)酶活力和蛋白質(zhì)含量（冰上），余做下一步乙醇抽提（級(jí)分III）向燒杯中的級(jí)分II加入等體積95%乙醇，攪拌，冰浴10min4度10000rpm離心15min棄去上清，倒置于抽紙上瀝干，沉淀等量分裝于兩個(gè)1.5ml的EP管中，4℃保存，做為下兩次實(shí)驗(yàn)中的酶（級(jí)分III）冰浴和離心的同時(shí)，可以開始做級(jí)分I和級(jí)分II的蛋白質(zhì)含量測(cè)定，酶活測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以零號(hào)管調(diào)零，測(cè)520nm光密度。以葡萄糖含量為橫坐

5、標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)試劑ml012345標(biāo)準(zhǔn)糖溶液5mM00.60.81.01.21.40.1M醋酸緩沖液2.01.41.21.00.80.60.1MNaOH溶液2.52.52.52.52.52.5二硝基水楊酸溶液0.50.50.50.50.50.5混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以零號(hào)管調(diào)零，測(cè)520nm光密度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)試劑ml012345標(biāo)準(zhǔn)糖溶液2mg/ml00.20.40.60.81.00

6、.1M醋酸緩沖液0.20.20.20.20.20.2H2O1.81.61.41.21.00.80.1MNaOH溶液2.52.52.52.52.52.5二硝基水楊酸溶液0.50.50.50.50.50.5混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min酶活測(cè)定（注意保留原管酶液，以備**）以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管調(diào)零，測(cè)520nm光密度值。以測(cè)定管的光密度值減去對(duì)照管光密度值，求得的差值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的糖含量管號(hào)試劑ml測(cè)定管對(duì)照管級(jí)分I(3管)級(jí)分II（3管）級(jí)分I（3管）級(jí)分II（3管）10%蔗糖溶液

7、0.60.60.1M醋酸緩沖液1.31.325℃水浴3min酶（1:10,1:50，1:100）各0.125℃水浴5min0.1MNaOH溶液2.52.5二硝基水楊酸試劑0.50.5酶（1:10,1:50，1:100）各0.1混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min酶活測(cè)定（注意保留原管酶液，以備**）以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管調(diào)零，測(cè)520nm光密度值。以測(cè)定管的光密度值減去對(duì)照管光密度值，求得的差值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的糖含量管號(hào)試劑ml測(cè)定管對(duì)照管級(jí)分I(3管)級(jí)分II（3管）級(jí)分I（3管）級(jí)分I

8、I（3管）300mM蔗糖溶液0.60.60.1M醋酸緩沖液0.20.2H2O1.11.125℃水浴3min酶（1:10,1:50，1:100）各0.125℃水浴5min0.1MNaOH溶液2.52.5二硝基水楊酸試劑0.50.5酶（1:10,1:50，1:100）各0.1混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)方法）參照蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(預(yù)制)，計(jì)算出各級(jí)分蛋白質(zhì)含量。y=0.0035xX代表溶液的濃度（mg/ml），Y代表595nm下的吸收值樣品0.5ml+考馬斯亮