蔗糖酶的制備和活力測定

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1、蔗糖酶的制備和比活力的測定酵母蔗糖酶的制備各級分酶溶液活性的測定（1）葡萄糖標準曲線的制備（2）蔗糖酶水解蔗糖后還原糖含量的測定3.各級分蔗糖酶溶液蛋白質(zhì)含量的測定4.各級分蔗糖酶溶液比活力的計算實驗內(nèi)容比色法測酶活性的原理酶活力單位（U）：在特定條件下反應1min,每產(chǎn)生1mmol底物所需要的酶量，或轉(zhuǎn)化底物中1mmol的有關基團的酶量。實際應用是1ml酶液所產(chǎn)生底物的量定為1ml酶液的活力酶的比活力:每mg酶蛋白質(zhì)所具有的酶活力在蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖,最適pH值為3.5-5.5。通過測定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測定蔗糖酶的活力，同時測定蛋白含量，從而

2、求得酶的比活力。制備蔗糖酶(冰上操作！)研磨水抽提（級分I）機械破碎，提取水溶性蛋白成分（留出1.5ml測酶活力和蛋白質(zhì)含量，余做下一步）熱抽提（級分II）：去除部分熱變性蛋白雜質(zhì)（留出1.5ml測酶活力和蛋白質(zhì)含量，余做下一步）乙醇抽提（級分III）：有機溶劑沉淀濃縮蔗糖酶等量分裝在兩個1.5ml的EP管中，4℃保存，做為下兩次實驗中的酶酶分離提純的總目標是提高回收率及純度，保持較高的酶比活力（低溫操作）研磨水抽提（級分I）將研缽放入冰中，預冷去離子水稱10g酵母和約5g二氧化硅，放入研缽中緩慢加入預冷的去離子水30ml，每次加2ml，邊加邊研磨；研磨30分鐘以上，直至酵母細胞大

3、部分研碎將混合物轉(zhuǎn)入兩個離心管中，平衡，4度10000rpm離心15min用滴管將上清水相轉(zhuǎn)入另一個清潔離心管中，再次離心15min上清轉(zhuǎn)入量筒測體積，用1M乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.0留出1.5ml測酶活力和蛋白質(zhì)含量（冰上），余做下一步熱抽提（級分II）將級分I水浴50度30分鐘，不斷輕搖此時可以開始做葡萄糖標準曲線冰浴迅速冷卻3-5分鐘，4度10000rpm離心15min將上清轉(zhuǎn)入小燒杯，置于冰上留出1.5ml測酶活力和蛋白質(zhì)含量（冰上），余做下一步乙醇抽提（級分III）向燒杯中的級分II加入等體積95%乙醇，攪拌，冰浴10min4度10000rpm離心15min棄去上清，倒置于抽

4、紙上瀝干，沉淀等量分裝于兩個1.5ml的EP管中，4℃保存，做為下兩次實驗中的酶（級分III）冰浴和離心的同時，可以開始做級分I和級分II的蛋白質(zhì)含量測定，酶活測定葡萄糖標準曲線的制備以零號管調(diào)零，測520nm光密度。以葡萄糖含量為橫坐標，以光密度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線管號試劑ml012345標準糖溶液5mM00.60.81.01.21.40.1M醋酸緩沖液2.01.41.21.00.80.60.1MNaOH溶液2.52.52.52.52.52.5二硝基水楊酸溶液0.50.50.50.50.50.5混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min葡萄糖標準曲線的制備以零號管調(diào)零，測520

5、nm光密度。以葡萄糖含量為橫坐標，以光密度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線管號試劑ml012345標準糖溶液2mg/ml00.20.40.60.81.00.1M醋酸緩沖液0.20.20.20.20.20.2H2O1.81.61.41.21.00.80.1MNaOH溶液2.52.52.52.52.52.5二硝基水楊酸溶液0.50.50.50.50.50.5混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min酶活測定（注意保留原管酶液，以備**）以標準曲線的“0”管調(diào)零，測520nm光密度值。以測定管的光密度值減去對照管光密度值，求得的差值從標準曲線上查得相應的糖含量管號試劑ml測定管對照管級分I(3管)

6、級分II（3管）級分I（3管）級分II（3管）10%蔗糖溶液0.60.60.1M醋酸緩沖液1.31.325℃水浴3min酶（1:10,1:50，1:100）各0.125℃水浴5min0.1MNaOH溶液2.52.5二硝基水楊酸試劑0.50.5酶（1:10,1:50，1:100）各0.1混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min酶活測定（注意保留原管酶液，以備**）以標準曲線的“0”管調(diào)零，測520nm光密度值。以測定管的光密度值減去對照管光密度值，求得的差值從標準曲線上查得相應的糖含量管號試劑ml測定管對照管級分I(3管)級分II（3管）級分I（3管）級分II（3管）300mM蔗糖溶液

7、0.60.60.1M醋酸緩沖液0.20.2H2O1.11.125℃水浴3min酶（1:10,1:50，1:100）各0.125℃水浴5min0.1MNaOH溶液2.52.5二硝基水楊酸試劑0.50.5酶（1:10,1:50，1:100）各0.1混勻，沸水浴5min，流水冷卻3min蛋白質(zhì)含量的測定（考馬斯亮藍方法）參照蛋白質(zhì)濃度標準曲線(預制)，計算出各級分蛋白質(zhì)含量。y=0.0035xX代表溶液的濃度（mg/ml），Y代表595nm下的吸收值樣品0.5ml+考馬斯亮