環(huán)境微生物的分離與鑒定技術(shù)

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1、第八章環(huán)境微生物的分離與鑒定技術(shù)微生物純培養(yǎng)的分離方法微生物分類鑒定的經(jīng)典方法微生物的快速鑒定技術(shù)API細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)Enterotube系統(tǒng)微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù)DNA堿基組成(G+C)mol%分析Biolog方法鑒定環(huán)境微生物群落技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)核酸雜交技術(shù)DNA芯片技術(shù)DNA指紋圖譜技術(shù)一、微生物純培養(yǎng)的分離方法固體平板分離純培養(yǎng)稀釋平板法平板劃線法單細胞分離法菌絲尖端分離法液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)利用選擇培養(yǎng)基分離二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法指長期以來在常規(guī)鑒定中普遍采用的一些關(guān)于形態(tài)、生理、生化、生態(tài)、生活史

2、和血清學(xué)反應(yīng)等指標的鑒定方法。微生物分類鑒定的依據(jù)：形態(tài)特征個體形態(tài)特征培養(yǎng)特征生理生化特征常用的生化反應(yīng)：糖發(fā)酵試驗、VP試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用試驗、硫化氫試驗、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、尿素酶試驗等二、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法鑒定方法：一般先根據(jù)形態(tài)特征鑒別其屬于哪一大類(細菌、放線菌、酵母菌或霉菌)再根據(jù)生理生化特征、生態(tài)特征、免疫特征和遺傳特征等，借助于檢索表或鑒定手冊來依次確定是屬于哪個目、科、屬、種對于不同的微生物有不同的重點鑒定指

3、標三、微生物的快速鑒定技術(shù)API細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)(簡易診檢技術(shù)、數(shù)碼分類鑒定法)ADHODCH2STDAVPGLUINORHAMELARAONPGLDCCITUREINDGELMANSORSACAMY三、微生物的快速鑒定技術(shù)Enterotube系統(tǒng)美國Roche公司生產(chǎn)的Enterotube系統(tǒng)Biolog法Biolog測定原理：微孔板，每板含有96個孔，其中95個孔中加入了95種單一碳源和四唑染料，另外一個未加碳源的孔中加水為對照，環(huán)境微生物接種至孔中，孔中一旦有電子轉(zhuǎn)移，四唑染料就會變?yōu)樽仙?，顏色的深淺可以反映環(huán)境微生物對碳源的

4、利用程度該方法由美國BIOLOG公司于1989年開發(fā)成功，至今已能鑒定包括細菌、酵母菌和霉菌在內(nèi)的2000多種病原微生物和環(huán)境微生物。三、微生物的快速鑒定技術(shù)四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù)Biolog法Biolog系統(tǒng)組成：96個孔微孔板讀數(shù)器：讀取一波長下小孔內(nèi)吸光度及變化微機系統(tǒng)：與讀數(shù)器相連，自動完成數(shù)據(jù)采集、傳輸、存貯與分析方法操作平板選擇樣品制備加樣培育與讀數(shù)數(shù)據(jù)分析四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測定DNA(G+C)mol%值是微生物(除少數(shù)以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒)的一個基本遺傳特征，對特定微生物

5、來說，(G+C)mol%是恒定的。(G+C)mol%=(G+C)(mol)/(A+T+G+C)(mol)×100%(G+C)mol%的變化范圍較廣，原核生物為20-80，真核生物為30-60。完全不同的微生物可能有相近的(G+C)mol%，但(G+C)mol%有明顯差異的微生物肯定不會屬于同一個種。一般認為，種內(nèi)菌株間(G+C)mol%相差不超過4%，屬內(nèi)菌株間相差不超過10%，相差低于2%時沒有分類學(xué)意義四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù)DNA(G+C)mol%值的測定DNA(G+C)mol%值可所用測定方法的不同和測定誤差等而有差異該

6、方法操作簡單，但分率力不高(G+C)mol%的測定方法熱變性溫度測定法(Tm法)紙層析法高效液相色譜法浮力密度法四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù)核酸雜交技術(shù)核酸雜交是指具有一定互補序列的兩條核酸單鏈在液相或固相體系中按堿基互補配對原則締結(jié)成異質(zhì)雙鏈的過程DNA-DNA同源性分析DNA-rRNA同源性分析雜交方法固相雜交法：一是待測菌的DNA或RNA，二是用于檢測的已知序列DNA或片段，即探針四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù)DNA芯片技術(shù)DNA芯片技術(shù)是指將多達成千上萬種的探針分子按照特定的排列方式固定在固相載體(多數(shù)采用玻片)上，組成密集的

7、微點陣或陣列，利用核酸雜交原理，用已知序列的DNA分子，按照堿基互補配對的原則，與標記的特異性單鏈DNA或RNA分子雜交形成雙鏈，通過檢測雜交信號的強弱來判斷樣品中靶分子的數(shù)量，實現(xiàn)核酸序列的分子識別。DNA芯片技術(shù)的最大優(yōu)勢是可以同時、快捷、準確地分析數(shù)以千計基因組的信息DNA芯片技術(shù)的改進使得DNA診斷不斷小型化并具有高效率。四、微生物的現(xiàn)代分類檢測技術(shù)16SrRNA序列分析技術(shù)基本原理細菌體內(nèi)有3種不同的RNA，即mRNA、rRNA和tRNA。它們分別行使著不同的功能，其中rRNA可將遺傳信息得以表達，轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，它在所有細

8、菌中都有一定的堿基序列和空間結(jié)構(gòu)。細菌種類不同，rRNA序列不同。原核生物的rRNA是由兩個亞基所組成：50S和30S，而30S亞基進一步由3種類型組成，即23S、16S和5SrRNA，它們分別含有約2900、1500和120個核苷酸