犬細小病毒核酸疫苗制備及免疫試驗

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1、犬細小病毒核酸疫苗制備及免疫試驗邱薇1，范泉水1，李作生1，楊美峰1，鄭穎1，李麗紅1，王雙印1，李江1，夏咸柱2（1.成都軍區(qū)聯(lián)勤部軍事醫(yī)學(xué)研究所，云南昆明650032；2.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春130062）摘要：以犬細小病毒基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR方法擴增了全長VP1基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和NotⅠ/BamHⅠ雙酶切后與同樣處理的真核表達載體pIRES進行連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞JM109中，篩選了真核重組表達質(zhì)粒pIRESVP1，并進行了序列測定。對6只9月齡犬分別接種不同劑量的pIRESVP1或空載體質(zhì)粒及生理鹽水，8周接種1次，每次接種前采血，

2、測定血清的血凝抑制抗體效價，第2次免疫后即可檢測到較高的血清效價。在第3次接種4周后，對全部實驗犬進行攻毒，攻毒后第7天及第14天時采血，測定血清的血凝抑制抗體效價。所有接種pIRESVP1疫苗的犬均能抵抗CPV強毒的攻擊，而接種空載體質(zhì)粒和生理鹽水的對照犬則全部發(fā)病。證明所構(gòu)建的核酸疫苗（pIRESVP1）能使犬免受犬細小病毒強毒的感染。關(guān)鍵詞：核酸疫苗；犬細小病毒；免疫犬細小病毒（Canineparvovirus,CPV）于1978年首次發(fā)現(xiàn)，是細小病毒科中的一個自律性細小病毒，病毒粒子小，無囊膜，屬單鏈DNA病毒。CPV屬貓細小病毒亞群，感染犬，在幼齡犬中引起嚴(yán)重的腸炎，在新

3、生幼犬中引起心肌炎。CPV和貓泛白細胞減少癥病毒（FPV）核衣殼蛋白的氨基酸序列有98%的同源性[1-2]，由于高度的同源性以及近年來犬病的嚴(yán)重流行，CPV被認為是FPV的一個新宿主變異株[3]。CPV核衣殼基因編碼兩個重疊蛋白VP1和VP2，VP2是主要的核衣殼蛋白，從VP1開放閱讀框的一個框架內(nèi)ATG編碼子開始翻譯。VP3是完整的VP2核衣殼N末端除去15個～20個氨基酸形成的。VP1約占CPV核衣殼蛋白的10%，其余90%由VP2和VP3組成。表位圖譜試驗表明，結(jié)合中和抗體的全部抗原決定簇都在VP2中，VP1特有區(qū)域中還發(fā)現(xiàn)一個Ｔ細胞表位[4]。核酸疫苗（nucleicaci

4、dvaccines，NAVs）就是把能引起機體保護性免疫反應(yīng)的病原體抗原的編碼基因克隆到真核質(zhì)粒表達載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi)，通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，使外源基因在活體內(nèi)表達，產(chǎn)生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，從而達到預(yù)防和治療疾病的目的。NAVs誘導(dǎo)體液和細胞免疫，不復(fù)制，不感染宿主，易于生產(chǎn)，以及在室溫下穩(wěn)定性好，還提高了毒株間的交叉保護且保持病毒抗原的天然形式[5]。這些性質(zhì)使NAVs比常規(guī)疫苗和重組疫苗更具優(yōu)越性，具有控制人和動物傳染性疾病的潛力。核酸疫苗已實驗性地用于鼠，以抗各種病毒和人的腫瘤相關(guān)抗原，如流感病毒、

5、人類免疫缺陷病毒Ｉ型、狂犬病毒、乙型肝炎病毒、牛皰疹病毒Ⅰ型、人癌胚抗原以及淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒。傳統(tǒng)的滅活和致弱的活病毒（MLV）CPV疫苗含整個病毒粒子，這兩種疫苗有較大的免疫原性，新一代MLVCPV疫苗克服了部分母源抗體問題，小劑量疫苗就可產(chǎn)生更高效的免疫[6-8]。其他的CPV疫苗還有利用桿狀病毒表達系統(tǒng)的重組疫苗[9]和合成肽疫苗[10-11]，這些疫苗與佐劑一起接種犬后，可誘導(dǎo)抗CPV的免疫保護。但NAVs有避免應(yīng)用有毒佐劑的優(yōu)點，另外，重組疫苗只激發(fā)一次免疫反應(yīng)，需多次接種才能獲得保護，而NAVs可持續(xù)表達CPV病毒抗原，可產(chǎn)生比重組疫苗更好的免疫反應(yīng)。合成肽疫

6、苗局限于限制了抗原的表位，而CPV的NAVs表達天然、完整的病毒抗原蛋白，能更好地刺激免疫系統(tǒng)。本研究用CPV全長VP1基因構(gòu)建了真核重組表達載體（pIRESVP1），該載體可誘導(dǎo)犬產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答，使其能夠抵抗強毒的攻擊，現(xiàn)報告如下。1材料與方法1.1試劑、細胞株及動物限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ及T4DNA連接酶購自寶生物(大連)有限工程公司。pIRES載體由本實驗室保存。DNA膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。大腸埃希菌JM109感受態(tài)細胞由本實驗室制備。貓腎（F81）細胞、CPV毒種由本實驗室保存。6只混合飼養(yǎng)的昆明犬為市售，CPV血凝抑制抗體效價≤2。1

7、.2引物根據(jù)文獻合成一對引物，上游引物中含BamHⅠ限制位點，下游引物中含NotⅠ限制位點，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：P15′-CGGGATCCGAGACGACTTGGATTAAGGTA-3′；P25′-GTGCGGCCGCTAGTTGATATGTAATAAAC-3′。1.3方法1.3.1CPVDNA的制備用從感染犬糞便中提取的CPV2b型病毒接種貓腎（F81）細胞，收集上清液，濃縮，用苯酚∶氯仿（1∶1）抽提5次，乙醇沉淀DNA，溶解于10mm