[離子交換色譜]離子交換層析、凝膠色譜、離子交換纖維素色譜法教案

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1、[離子交換色譜]離子交換層析、凝膠色譜、離子交換纖維素色譜法[離子交換色譜]離子交換層析、凝膠色譜、離子交換纖維素色譜法篇一:離子交換層析、凝膠色譜、離子交換纖維素色譜法離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的1種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質(zhì)交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀(jì)40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進(jìn)入生物化學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的1種層析方法，廣泛

2、的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有:離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂。離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂;而帶有負(fù)電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子在PH高于其等電點(diǎn)的溶液中-COOH會部分解離釋放質(zhì)子從而帶負(fù)電。蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷時(shí)叫做陰離子交換，蛋白質(zhì)帶有正電荷時(shí)叫做陽離子交換。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子

3、上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。離子交換層析法分離氨基酸原理:所用樣品為天冬氨酸和組氨酸的混合液，分別屬酸性氨基酸、堿性氨基酸，用強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂Dowex50，在一定的洗脫條件下洗脫，將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反應(yīng)生成有色化合物進(jìn)行氨基酸鑒定1、層析:將Dowex50裝柱后，用0.1mol/LNaOH清洗樹脂5分鐘。再用pH4.2檸檬酸緩沖液平衡10分鐘。加樣8

4、滴。當(dāng)樣品進(jìn)入樹脂后，加入pH4.2檸檬酸緩沖液洗脫加樣后立即收集，每管收集3ml。當(dāng)?shù)谝环逡怀霈F(xiàn)，換用0.1mol/LNaOH作洗脫液，直至第二峰收集完畢。用pH4.2緩沖液再平衡10分鐘，再生。2、檢測:從第2管起每收集管中加入2ml茚三酮顯色液，充分混合，沸水浴15分鐘，自來水冷卻，觀察氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)，若生成紫色化合物，則說明收集到氨基酸。第四節(jié)離子交換色譜LujiangYuanSchoolofPharmaceuticalScienceSouthwestUniversity離子交換色譜的發(fā)展?1903年，泡沸石:離子交換劑的分類陽離子交換劑:

5、強(qiáng)酸型和弱酸型?可電離的基團(tuán)磺酸基磷酸基羧酸基酚羥基陰離子交換劑:強(qiáng)堿型和弱堿型可電離的基團(tuán)伯胺基仲胺基叔胺基季胺基一、陽離子交換樹脂1強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂具有酸性基團(tuán)，如應(yīng)用最廣泛的強(qiáng)酸性磺酸型聚苯乙烯樹脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，經(jīng)濃硫酸磺化而制得的聚合物。化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，5,10年，耐強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化劑和還原劑,不溶于酸、堿及常見的有機(jī)溶劑。耐熱超過100?C。2弱酸型子交換樹脂?甲基丙烯酸和二乙烯苯基聚合，功能基羧基。根據(jù)活性基團(tuán)離解出H+能力的大小不同，陽離子交換樹脂分為強(qiáng)酸性和弱酸性兩種。例如含-SO3的為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，常

6、用R-SO3H表示，含COOH和-OH的弱酸性陽離子交換樹脂，分別用R-COOH和R-OH表示。強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂應(yīng)用較廣泛，弱酸性陽離子交換樹脂的H+不易電離，所以在酸性溶液中不能應(yīng)用，但它的選擇性較高而且易于洗脫。二、陰離子交換樹脂???與陽離子交換樹脂具有同樣的有機(jī)骨架，只是所聯(lián)的活性基團(tuán)為堿性基團(tuán)。季胺3)H+不易電離，強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂;伯胺基、仲胺基和叔胺基2)的樹脂為弱堿性陰離子交換樹脂。水化:R-NH3OH、R-NH2CH3OH、R-NH2OH和RN3OH,OH-可被陰離子交換和洗脫。,陰離子交換樹脂的化學(xué)穩(wěn)定性及耐熱性能都不如陽離子交換

7、樹脂穩(wěn)定。交聯(lián)度?樹脂中所合交聯(lián)劑的百分率稱為重量交聯(lián)度。例如強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂:苯乙烯聚合而成為長的鏈狀分子,二乙烯苯把各鏈狀分子聯(lián)成立體型的網(wǎng)狀體。如果二乙烯苯在原料總量中占10%。則稱該樹脂的交聯(lián)度為10,。交聯(lián)度樹脂的交聯(lián)度越大，則網(wǎng)眼越小，交換時(shí)體積大的離子進(jìn)入樹脂便受到限制。但提高了交換的選擇性:另外，交聯(lián)度大時(shí)，形成的樹脂結(jié)構(gòu)緊密，機(jī)械強(qiáng)度高。但是如果交聯(lián)度過大則對水的膨脹性能差，交換反應(yīng)的速度慢，因此要求樹脂的交聯(lián)度一般為4-14,。交換容量??每克干樹脂所含活性基團(tuán)的物質(zhì)的量，而實(shí)際交換容量是指在實(shí)驗(yàn)條件下，每克干樹脂能交換離子的物質(zhì)的量

8、。稱取干樹脂1克，置于250mL錐形瓶中、準(zhǔn)確加入0