《固定化酶》課件

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1、第三章酶的固定化第一節(jié)酶的固定化第二節(jié)輔酶的固定方法第三節(jié)固定化細(xì)胞第四節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素第五節(jié)固定化酶催化反應(yīng)動力學(xué)對于現(xiàn)代工業(yè)來說，酶不是一種理想的催化劑絕大多數(shù)水溶性的酶，酶蛋白對外界環(huán)境很敏感，極易失活。催化結(jié)束后極難回收，只能進(jìn)行分批生產(chǎn)。解決辦法??第一節(jié)酶的固定化一、固定化酶（ImmobilizedEnzyme）定義：是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可回收重復(fù)使用。固定化酶優(yōu)點(diǎn)：(1)簡化了提純工藝(2)可以裝塔連續(xù)反應(yīng)(3)有利于工藝自動化和微電腦化(4)多次使用(5)較游離酶

2、相比能適應(yīng)于多酶反應(yīng)(6)產(chǎn)品質(zhì)量高，成本低固定化酶缺點(diǎn)：①酶活力有損失②工廠初始投資大③只能用于可溶性底物，對大分子底物不適宜④與完整菌體相比，需要輔助因子的催化反應(yīng)不適宜于多酶反應(yīng)固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)固定化酶的制備原則①必須注意維持酶的催化活性及專一性。②固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度有利于生產(chǎn)自動化，連續(xù)化，不能因機(jī)械攪拌而破碎或脫落。③固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量。④酶與載體必須結(jié)合牢固能回收貯藏，反復(fù)使用。⑤固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。固定化酶的

3、制備原則⑥固定化酶應(yīng)容易與產(chǎn)物分離，即能通過簡單的過濾或離心就可回收和重復(fù)使用。⑦固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。⑧充分考慮到固定化酶制備過程和應(yīng)用過程中的安全因素。固定化載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體的形式載體的結(jié)構(gòu)載體的性質(zhì)酶偶聯(lián)量或裝載量和實(shí)效系數(shù)二、固定化酶的制備方法結(jié)晶法分散法物理吸附法離子結(jié)合法微囊法網(wǎng)格法包埋法化學(xué)結(jié)合法交聯(lián)法共價(jià)結(jié)合法非化學(xué)結(jié)合法1、物理吸附法(physicaladsorption)是通過氫鍵、疏水鍵等作用力將酶吸附于不溶性載體的方法。選擇載體的原則①要有巨大的比表面積②要有活潑的表面③便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。常用

4、的載體有：(1)有機(jī)載體：纖維素、骨膠原、火棉膠及面筋、淀粉等。(2)無機(jī)載體：氧化鉛、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、二氧化鈦等。無機(jī)載體的吸附容量較低，而且酶容易脫落。2、離子結(jié)合法(在工業(yè)上具廣泛的用途)將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化的一種方法。在適宜的pH和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換基團(tuán)間的相互作用而達(dá)到酶固定化的方法。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。⑴陰離子交換劑：二乙基氨基乙基(DEAE)—纖維素、混合胺類(ECTEDLA)-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、DEAE

5、-葡聚糖凝膠、AmberliteIRA-93、410、900等。⑵陽離子交換劑：羧甲基(CM)—纖維素、纖維素檸檬酸鹽、AmberliteCG50、IRC—50、IR—200、Dowex-50等。1969年，最早應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化氨基酰化酶就是使用多糖類陰離子交換劑DEAE-SephadexA-25固定化的。吸附法特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可同時(shí)達(dá)到純化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。酶活性中心不易被破壞和酶高級結(jié)構(gòu)變化少，酶活力損失很少。缺點(diǎn)：酶與載體相互作用力弱導(dǎo)致酶易脫落。

6、吸附程度的影響因素:1.pH：影響載體和酶的電荷變化,從而影響酶吸附2.離子強(qiáng)度：一般認(rèn)為鹽阻止吸附。3.蛋白質(zhì)濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。4.溫度：蛋白質(zhì)往往是隨溫度上升而減少吸附。5.吸附速度：蛋白質(zhì)在固體載體上的吸附速度要比小分子慢得多。6.載體：非多孔性載體---顆粒越小吸附力越強(qiáng)。多孔性載體--要考慮酶的大小和吸附面積的大小。3、包埋法包埋法是將酶物理包埋在高聚物網(wǎng)格內(nèi)的固定化方法。如將聚合物的單體和酶溶液混合后，再借助聚合促進(jìn)劑的作用進(jìn)行聚合，將酶包埋于聚合物中以達(dá)到固定化的目的。包括

7、凝膠包埋和微囊化包埋兩種。(1)凝膠包埋法：將酶分子包埋在凝膠高聚物網(wǎng)格內(nèi)的包埋方法。聚丙烯酰胺、海藻酸鈉、K-角叉菜膠（卡拉膠）、膠原和明膠等先把丙烯酰胺單體、交聯(lián)劑（如N,N-甲叉雙丙烯酰胺）和懸浮在緩沖溶液中的酶混合，然后加入聚合催化劑（如二甲氨基丙腈與過硫酸鉀）使之開始聚合，結(jié)果就在酶分子周圍形成交聯(lián)的高聚物網(wǎng)絡(luò)。特點(diǎn):它的機(jī)械強(qiáng)度高，在包埋的同時(shí)使酶共價(jià)偶聯(lián)到高聚物上。缺點(diǎn)：酶容易漏失，以低分子量蛋白質(zhì)為甚。調(diào)整交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)程度可以得到克服。聚丙烯酰胺包埋海藻酸鈉它從海藻中提取出來，可被多價(jià)離子Ca2+、Al3+凝膠化，

8、操作簡單經(jīng)濟(jì)。K-角叉萊膠（卡拉膠）卡拉膠(K-Carrageenin)是由角叉菜(又稱鹿角菜；Cawageen)中提取的一種多糖?？梢岳鋮s成膠或與二、三價(jià)金屬離子成膠。包埋條件溫和無毒性，機(jī)械強(qiáng)度好。固定化的酶活回收率