放線菌抑菌圈實驗

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1、放線菌主要分布在土壤中（主要是鏈霉菌），其數(shù)量僅次于細菌。一般在中性偏堿性、有機質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。1材料與方法1.1材料1.1.1儀器本項目研究所用主要儀器為：高壓蒸汽滅菌鍋，生化培養(yǎng)箱，分析天平，電熱恒溫鼓風干燥箱，微波爐，空氣恒溫震蕩器。1.1.2試劑NaOH，乙醇，10%酚等。1.1.3菌種本實驗所用指示菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)。1.1.4培養(yǎng)基（1）高氏I號培養(yǎng)基（g/L）[3]：可溶性淀粉20；NaCl0.5；KNO31；K2HPO4?3H2O0.5；MgSO

2、4?7H2O0,01；FeSO4?7H2O0.5；瓊脂粉15-25，加去離子水至1L,pH7.4-7.6。121℃,滅菌20min。（2）牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）[3]：牛肉膏3；蛋白胨10；NaCl5；瓊脂粉15-20，加去離子水至1L,pH7.0-7.2。121℃,滅菌20min。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）[4]：蔗糖45；黃豆粉25；KH2PO40.2；NaCl1；NaSO40.1；FeSO40.01；CaCO33；加去離子水至1L，pH7.2。121℃，滅菌20min。1.2方法1.2.1采土樣選取有機質(zhì)豐富、通氣性良好的、偏堿性的土壤，（pH7.0-

3、7.5）。用小產(chǎn)挖取地表下5-25cm的土壤5g。1.2.2放線菌的篩選（1）土壤懸濁液梯度稀釋：將5.0g土壤加入到50ml無菌水中，震蕩10min制備土壤懸液；用無菌吸管吸取1ml土壤懸液，加入到9ml無菌水中作10倍稀釋；按1:10稀釋至10-3、10-4、10-5[3]。（2）倒平板：取6套無菌平皿，在皿底貼上標簽，注明土壤稀釋液的稀釋度（10-3、10-4、10-5，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿）。然后在融化并冷卻至50℃左右的高氏I號培養(yǎng)基加入10％的酚數(shù)滴，混合均勻；在每個培養(yǎng)皿中倒15-20ml左右，待冷凝備用[3]。（3）涂布：用1ml無菌吸管分別精確地

4、吸取10-3、10-4、10-5的稀釋菌液1ml，對號放入編好號的無菌培養(yǎng)皿中，每一濃度對應兩個平板。用無菌涂布棒（從濃度小的開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個平板表面涂勻[3]。（4）培養(yǎng)：接種完畢，將平皿放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，觀察平皿上放線菌菌落生長情況[3]。（5）平板劃線分離純化：挑取培養(yǎng)7天后的平皿上的單個放線菌菌落，在淀粉瓊脂平皿上進行三區(qū)劃線法一次分離純化，28℃培養(yǎng)7天。若不純，則如上方法進一步分離純化，直至純培養(yǎng)為止，并觀察放線菌菌落特征[3,4]。1.2.3鑒定菌種制作裝片，鏡檢，觀察菌落特征，判斷是否屬于放線菌。1.2.4產(chǎn)抗生素

5、放線菌的篩選（1）初篩：配制高氏I號液體培養(yǎng)基，分裝于8個250mL的三角燒瓶中，每瓶50ml；鑒定出的菌株接種于高氏I號液體培養(yǎng)基中，于28℃，160r/min振蕩培養(yǎng)7天。（2）抑菌實驗：配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分別倒15ml于12個培養(yǎng)皿中，冷卻后作下層平板，將三種指示菌菌懸液和牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)液混勻后倒上層平板，并在其上放入牛津杯，在牛津杯中分別加入經(jīng)離心（4000rmp，15min）的供試菌培養(yǎng)液0.1ml，于28℃培養(yǎng)24小時，觀察抑菌圈情況，并測量其直徑[5.6]。（3）復篩：配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝于6個250ml三角燒瓶中。將初篩到的放線菌培養(yǎng)液以6

6、%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有50ml初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃，160r/min培養(yǎng)4天【5】，得發(fā)酵液。2結(jié)果與討論2.1結(jié)果指示菌菌種號大腸桿菌金黃色葡萄球菌2.2討論2.2.1關(guān)于菌種鑒定放線菌可以產(chǎn)生色素，且放線菌代表屬也分好幾種。其菌落一般為圓形，菌落質(zhì)地致密表面呈較緊密的絨狀或堅實、干燥、多皺、地衣狀、表面干燥，可作為鑒別菌種的基本參考依據(jù)。孢子絲生長到一定階段可形成孢子。由于孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表現(xiàn)出特定的顏色，而且在一定條件下比較穩(wěn)定，故也是鑒定菌種的依據(jù)之一（但孢子的形態(tài)和大小不能籠統(tǒng)地作為分類鑒定的重要依據(jù)）。2.2.2關(guān)

7、于放線菌的分離純化分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預先處理，或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細菌，霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨菌落，并可得到純菌株。