《抗體制藥》課件

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1、第五章　抗體工程制藥抗體藥物的生產(chǎn)傳統(tǒng)的方法——抗血清淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)如何獲得需要的淋巴細(xì)胞？如何體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞？1997年全球抗體藥物銷售額為3.1億美元，同期全球藥品銷售額為3028億美元，市場份額為千分之一到2008年，增長至400億美元，同期全部藥品銷售7730億美元，市場份額提升至5.2%抗體藥物年銷售額復(fù)合增速高達56%，是總藥品銷售增速的6倍2009年，美國FDA批準(zhǔn)的6項新的生物制品許可申請中，有4只產(chǎn)品屬于單抗藥物,歐洲7個2010年強生的抗腫瘤壞死因子(TNF)-α單克隆抗體Remicade銷量達7

2、4億美元羅氏的Rituxan銷售額達到65億美元羅氏的抗Her-2受體單克隆抗體赫賽?。℉erceptin）銷售額達到51億美元第一節(jié)抗體藥物概念及其特點一、抗體藥物概念通過細(xì)胞工程或基因工程生產(chǎn)的，用于診斷或治療的單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段、基因工程改造的抗體或免疫偶聯(lián)物統(tǒng)稱為抗體藥物免疫偶聯(lián)物生物導(dǎo)彈是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼由單克隆抗體與藥物、酶、毒素或放射性同位素等配合而成二、抗體藥物特點1.特異性1）與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合2）對靶細(xì)胞的選擇性2.多樣性1）抗原多樣性2）結(jié)構(gòu)多樣性3）抗體活性的多樣性4）免

3、疫偶聯(lián)物和融合蛋白的多樣性第二節(jié)雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體1975年，德國學(xué)者Kohler和英國學(xué)者Milstein合作研究將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫后的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，建立了能持續(xù)分泌抗棉樣細(xì)胞抗體的雜交瘤細(xì)胞，從而創(chuàng)立了具有劃時代意義的新技術(shù)，為此獲得了1984年醫(yī)學(xué)諾貝爾獎一、抗體的種類1.多克隆抗體多克隆抗體含有兩層意思：一是有含多個抗原位區(qū)的大分子刺激產(chǎn)生的、識別不同抗原位區(qū)的各種抗體；二是由體內(nèi)不同淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的、可針對同一抗原位區(qū)的多克隆抗體2.單克隆抗體僅識別抗原分子上同一抗原位區(qū)的由同一克隆細(xì)胞產(chǎn)

4、生的抗體為單克隆抗體傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞二、雜交瘤及雜交瘤技術(shù)細(xì)胞雜交的含義包括同一細(xì)胞的自融合或是在誘導(dǎo)物的作用下不同細(xì)胞間的融合淋巴細(xì)胞通過融合劑的作用和腫瘤細(xì)胞形成融合的雜交細(xì)胞稱雜交瘤細(xì)胞通過腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的融合，用于某些細(xì)胞特性的研究和生產(chǎn)所期望的免疫分子，稱為雜交瘤技術(shù)目前雜交瘤技術(shù)在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有兩種B淋巴細(xì)胞雜交瘤，即用骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞進行融合而制備抗體，也是引用最廣泛的一種T細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞融合而制備具有免疫活性的淋巴因子

5、通常人們所述的雜交瘤技術(shù)即知B淋巴細(xì)胞雜交瘤，也可稱為單克隆抗體技術(shù)三、單克隆抗體單克隆抗體是由一個骨髓瘤細(xì)胞和一個具有分泌抗體能力的B淋巴細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，通過無性繁殖形成的細(xì)胞系而獲得的這個細(xì)胞系的每個細(xì)胞均具有相同的特性且高度均一，這一細(xì)胞系分泌的抗體均一性極高，活性、亞基、親合力均相同單克隆抗體的特點抗體結(jié)構(gòu)高度均一?？贵w分子在結(jié)構(gòu)上高度均一，甚至在氨基酸的序列和空間結(jié)構(gòu)上都相同高度特異性?？贵w識別的是抗原分子上單一的抗原位區(qū)穩(wěn)定的生產(chǎn)特性。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是可以無性繁殖的細(xì)胞系第三節(jié)雜交瘤細(xì)胞系的建立一

6、、免疫B淋巴細(xì)胞的制備1.抗原凡是能具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)均可制備單克隆抗體，抗原可以是全病毒、亞單位或純化分子，也可以是蛋白質(zhì)、多糖、脂類等用于制備單克隆抗體的抗原在理論上講，純度要求就可以不高，也可以使混合抗原2.免疫動物的選擇目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系來自BALB/c小鼠和Lou大鼠免疫方法A.體內(nèi)免疫法B.脾內(nèi)免疫法C.體外免疫法二、骨髓瘤細(xì)胞的選擇在B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)中，主要是用多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞作為親本細(xì)胞，這種細(xì)胞是來自骨髓造血細(xì)胞的一種腫瘤，分泌單一抗體的漿細(xì)胞，并且衰變成不表達自身抗體或部分表達常見的骨髓瘤親

7、本細(xì)胞系有Sp2/0，NS-1，Y3，YB2三、免疫脾細(xì)胞的制備經(jīng)免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼球、斷頸等方法處死后，無菌摘取脾臟，研磨制取B淋巴細(xì)胞懸液，經(jīng)氯化銨破碎紅細(xì)胞后，洗滌并調(diào)整到（1～5）X107個／ml濃度備用四、細(xì)胞融合將免疫脾B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按照（5～10）：1混合后離心取上清，緩慢加入分子量在4000～6000的50％PEG1ml，間隔1分鐘后，緩慢加入無血清培養(yǎng)基，終止融合劑的作用，經(jīng)洗滌去除融合劑后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，分種于96孔板中五、特異雜交瘤細(xì)胞的選擇1.雜交瘤細(xì)胞的選擇融合后

8、，有雜交瘤細(xì)胞有骨髓瘤－B淋巴細(xì)胞、B淋巴瘤細(xì)胞－B淋巴瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞－骨髓瘤細(xì)胞，還有未融合的骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞一般用HAT培養(yǎng)液進行篩選m核酸補救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)胸苷(T)TKHGPRTTK-HGPRT-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶2.特異性抗體的篩選篩選出的雜交瘤細(xì)胞并不是都能分泌所期望的