GBT 18637-2002 牛病毒性腹瀉粘膜病診斷技術(shù)

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1、GB/T18637--2002前臺(tái)牛病毒性腹瀉/粘膜病(bovineviraldiarrhea/mucosaldisease>BVD/MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV瑪}起的牛的一種以粘膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉為特征的疾病應(yīng)用微量血清中和試驗(yàn)檢查BVD/MD抗體，具有其特殊意義，它不僅可以定性，而且還可以定量，并從抗體量的動(dòng)態(tài)變化中，可以判定病牛是以前感染過本病，還是現(xiàn)在正在感染過程中，從而為防治本病提供科學(xué)依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄c都是標(biāo)準(zhǔn)的附錄本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草

2、單位:中國(guó)獸藥監(jiān)察所、農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:邵振華、鄭志剛中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18637--2002牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforbovineviraldiarrhea/mucosaldisease范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛病毒性腹瀉/粘膜病(BVD/MD)的診斷技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于BVD/MD的流行病學(xué)調(diào)查和檢疫。2定義本標(biāo)準(zhǔn)采用下列定義。細(xì)胞玻片放置在萊頓氏(Lei沙ton's)管或其他用作培養(yǎng)細(xì)胞的小瓶中，長(zhǎng)有單層細(xì)胞的蓋玻片。3BVD/MD病毒分離與鑒定3.1材料準(zhǔn)備3.1.

3、1陽性參照毒株為牛粘膜病病毒俄勒岡毒株(OregonC,,V)o3.1.2BVD/MD熒光抗體(BVD/MD-FA)、陽性血清。3.1.3熒光顯微鏡:采用藍(lán)紫光為激發(fā)光的透射式或落射式熒光顯微鏡3.1.4犢牛(或胎牛)血清:無BVD/MD抗體和無污染。3.1.5細(xì)胞培養(yǎng)瓶扁瓶、Leighton's管、0.17mm厚度的蓋玻片(1.0cmX3.8cm或0.8cmx2.4cm),0.8m-1.0mm厚的普通玻璃載片，帶蓋濕盒。3.1.6溶液配制:pH7.0^-7.20.01mol/1,磷酸鹽緩沖液，pH9.0^-9.50.5mol/I碳酸緩沖甘油〔

4、見附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)〕31.7細(xì)胞培養(yǎng)液:見附錄B(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)。3.1.8原代細(xì)胞培養(yǎng)物:見附錄C(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)。3.2病毒分離3.2.1樣品的采集32.1.1對(duì)于牛群、種公牛的檢疫，無菌采血液或精液。3.2.1.2對(duì)懷疑為急性感染期或持續(xù)感染的牛，采血或鼻分泌物。3.2.1.3對(duì)流產(chǎn)、死胎，采胎兒的組織。3.2.1.4對(duì)懷疑為死于粘膜病的牛，可采集血塊和各組織，尤其是腸道集合淋巴組織。如果腸道樣品已發(fā)生白溶，可采扁桃體或淋巴結(jié)。3.2.2樣品處理3.2.2.1血液用常規(guī)方法分離血清。3.2-2.2凝血塊:凍融數(shù)次后，取析出的上清液(加人適

5、量的雙抗即青鏈霉素)。3.2.2.3組織樣品用含1000IU/m工雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液作1:10倍的乳劑，離心取上清液中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)f監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局2002-02-19批準(zhǔn)2002-05-01實(shí)施Gs/'r18637--20023.2-2.4精液凍融3次(或超聲波裂解處理)，用細(xì)胞培養(yǎng)液作1:10倍稀釋，離心取上清液32.2.5鼻分泌物:用含1000IU(mg)/mL雙抗，)的培養(yǎng)液4倍稀釋后，離心取上清液。以上各樣品處理后均需作無菌檢驗(yàn)3.2.3樣品的接種培養(yǎng)3.2.3.1將10ml牛辜丸原代細(xì)胞(見附錄C)接種于小扁瓶，置37C靜止培養(yǎng)

6、。培養(yǎng)到細(xì)胞形成80Y以上單層。3.2.3.2取出3.2.3.1中小扁瓶，倒去培養(yǎng)液，接種3.2.2.1~3.2.2.5的樣品，每瓶接種樣品1mL.每份樣品接種3瓶。3.2-3.3置37(、吸附2h-3ho3.2-3.4吸附后，將樣品倒去，加維持液[見附錄B中BI，另加3%犢牛血清(3.1.4)]10m工置37C恒溫培養(yǎng)32.3.5培養(yǎng)6d后，將其凍融3次，收集3瓶細(xì)胞及其培養(yǎng)基，混合后即為樣品分離細(xì)胞培養(yǎng)物3.3樣品分離物的病毒鑒定3.3.1分離物的細(xì)胞玻片培養(yǎng)33.11將1ml牛肇丸原代細(xì)胞懸液，接種于帶蓋玻片(3.l.5)的Leighto

7、n's管，置37C培養(yǎng)，至蓋玻片L細(xì)胞生長(zhǎng)成80%的單層33.1.2取3.3.1.1中4個(gè)工eighton's管，倒去培養(yǎng)液，每瓶接種3.2.3.5中樣品分離細(xì)胞培養(yǎng)物1ml。33.1.3置37C吸附2h一3h.3.3.1.4吸附后，加維持液1mL.置37C恒溫培養(yǎng)3de33.1.5取出細(xì)胞玻片、用磷酸鹽緩沖液(見附錄A中A1)輕輕漂洗，傾去液體，自然干燥。用純丙酮室溫固定10min一15min3.3.1.6取各組固定后的細(xì)胞玻片(樣品組取半數(shù)，余者在必要時(shí)作抑制染色試驗(yàn)用)，置濕盒內(nèi)，細(xì)胞面向上，滴加BVD/MD-FA(3.1.2)，并使免疫

8、熒光抗體(FA)鋪滿而又不溢出于細(xì)胞面。將濕盒蓋蓋嚴(yán)，置37C染色2h。隨后取出，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，傾去液體。3.3-1.7封片:將細(xì)胞面向下，