《核酸的研究方法》PPT課件

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1、第15章核酸的研究方法NucleicAcid制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過(guò)酸、過(guò)堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分離、提純和定量測(cè)定真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分離純化制備RNA時(shí)，最重要的是使RNase滅活：①所有容器都要經(jīng)過(guò)高溫處理，不能高溫高壓的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。②加入強(qiáng)變性劑（如胍鹽）使RNase失活；③在RNA的反應(yīng)體系內(nèi)加

2、入RNase的抑制劑（如RNasin)（二）RNA的分離（三）核酸含量的測(cè)定2、定糖法RNA：核糖→糠醛→→綠色物質(zhì)（670-680nm）DNA：脫氧核糖+二苯胺→蘭色物質(zhì)（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法1個(gè)A～50μg/ml雙鏈DNA～40μg/mlRNA或單鏈DNA3、定磷法核酸含磷量為9.5%1g磷相當(dāng)于10.5g核酸4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基對(duì)間形成復(fù)合物在紫外線(xiàn)照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核

3、酸純度的測(cè)定OD260／OD280二、核酸的沉降特性與超速離心不同構(gòu)象的核酸（線(xiàn)形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構(gòu)象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時(shí)：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離（一）核酸密度的測(cè)定G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10（二）測(cè)定DNA的G-C含量RNA＞DNA變性DNA

4、＞雙鏈DNA＞蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構(gòu)象（四）用于核酸的制備超螺旋DNA或用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣。三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳用于小片段DNA的分析相對(duì)分子質(zhì)量小于1000bp的DNA片斷和RNA的電泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析時(shí)不會(huì)分解樣品。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）（一）DNA的酶法測(cè)定四、核酸的核苷酸序列測(cè)定英國(guó)Sanger1955確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，1958獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1975設(shè)計(jì)出DNA測(cè)序法，1980獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)合成一段與待測(cè)DNA序列互補(bǔ)的DNA片段群。末端終止法——

5、Sanger2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑。MOV:MCB4.0DideoxysequencingofDNADNA序列分析儀：四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP（二）DNA的化學(xué)法測(cè)序：由Maxam和Gilbert所發(fā)明。其基本原理是用特異的化學(xué)試劑作用于DNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈。用4組不同的特異反應(yīng)，可使末端標(biāo)記的DNA分子切成不同長(zhǎng)度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經(jīng)變性膠電泳和放射自顯影得到測(cè)序圖譜4組特異的反應(yīng)如下：（1）G反應(yīng)：用硫酸二甲酯DMS使鳥(niǎo)嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起鳥(niǎo)嘌呤脫落，多核苷

6、酸鏈可在此處斷裂（2）G+A反應(yīng)：用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂（3）T+C反應(yīng)：用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基（4）C反應(yīng)：當(dāng)有鹽存在時(shí)，只有C與肼反應(yīng)，并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂32P-GCTACGTA：在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處：32p，32p-GCTAC在C處：32P-G和32P-GCTA在T處：32P-GC和32P-GCTACG硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTT

7、CGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）：*AC*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG肼（C+T）：*AC*ACT*ACTT*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG從下往上讀：CTACGTA，末端G不能讀出。32P*ACTTCGACAG（三）RNA的測(cè)序RNA的測(cè)序方法有3個(gè)：（1）用酶特異切斷RNA鏈：（2）用化學(xué)試劑裂解RNA（3）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA1995年K.Mullis發(fā)明。基本步驟為：1.設(shè)計(jì)一對(duì)引物以便有效擴(kuò)增所需要的DNA序列，并盡量減少可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物2.優(yōu)化反應(yīng)體系：包