《核酸的研究方法》PPT課件

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1、核酸的研究方法核酸的分離、提純和定量測定核酸的超速離心核酸的凝膠電泳核酸的核苷酸序列測定DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）DNA的化學(xué)合成制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分離、提純和定量測定真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl），據(jù)此，細(xì)胞破碎后采用高鹽提取，低鹽沉淀，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA

2、沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分離純化也可用SDS破碎細(xì)胞，蛋白酶K降解蛋白后，苯酚抽提，再用RNase分解除去RNA而獲得純化的DNA。制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：①容器用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。然后經(jīng)過高溫處理。DEPC能使蛋白質(zhì)乙基化而破壞RNase活性；②加入強(qiáng)變性劑（如胍鹽：可使所有蛋白質(zhì)變性）使RNase失活；③在RNA的反應(yīng)體系內(nèi)加入RNase的抑制劑（如RNasin)（二）RNA的分離①用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋

3、白（RNP）。鹽酸胍、苯酚等去蛋白②用酸性胍鹽/苯酚/氯仿抽提：異硫氰酸胍是極強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑。后用苯酚和氯仿多次除凈蛋白質(zhì)③用胍鹽/氯化銫將細(xì)胞抽提物進(jìn)行密度梯度離心，蛋白質(zhì)在最上面，DNA在中間，RNA沉在底部★mRNA的制備：oligo(dT)纖維素（瓊脂糖凝膠）親合層析法制備RNA的方法：（三）核酸含量的測定2、定糖法RNA：核糖→糠醛→→綠色物質(zhì)（670-680nm）DNA：脫氧核糖+二苯胺→蘭色物質(zhì)（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法1個A～50μg/ml雙鏈DNA～

4、40μg/mlRNA或單鏈DNA3、定磷法核酸含磷量為9.5%1g磷相當(dāng)于10.5g核酸4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間形成復(fù)合物在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比細(xì)胞或組織中核酸含量測定方法生物組織酸溶性物質(zhì)殘留物冷的稀酸抽提脂類物質(zhì)殘留物熱酸法冷酸法堿法殘留物酸抽提液(RNA+DNA)熱酸提取殘留物殘留物酸抽提液(DNA)熱酸提取酸抽提液(RNA)冷酸提取酸抽提液(RNA)殘留物(DNA)有機(jī)溶劑抽提堿降解再酸化純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA

5、比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核酸純度的測定OD260／OD280二、核酸的沉降特性與超速離心利用超離心技術(shù)，可以測定核酸的沉降常數(shù)和相對分子質(zhì)量。密度梯度沉降平衡超離心法在核酸分子構(gòu)象的研究中應(yīng)用頗廣。DNA分析時，常用氯化銫密度梯度。主要應(yīng)用于以下方面：核酸密度的測定測定DNA中的G-C含量溶液中核酸構(gòu)象的研究用于核酸的制備8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10

6、-10ρ：未知DNA的密度ρ0：為標(biāo)準(zhǔn)DNA的密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉(zhuǎn)軸的距離r0：已知DNA到轉(zhuǎn)軸的距離（一）核酸密度的測定G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系，因此可用能用該方法計算DNA堿基成分，計算公式為：ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10需注意的是：含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其實際浮力密度會降低，低于理論值，不能用該公式計算。（二）測定DNA的G-C含量RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質(zhì)，變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構(gòu)象（

7、四）用于核酸的制備不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構(gòu)象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來，利用EB（溴化乙錠）與核酸結(jié)合，能在紫外燈下發(fā)出熒光的特性，將目的區(qū)帶收集。是當(dāng)前核酸研究中最常用的方法。有許多的優(yōu)點：簡單、快速、靈敏、成本低。常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳用于大片段DNA或RNA的分離，精度低，但分離范圍廣。電泳遷移率決定于：（1）核酸分子的大小（遷移率與相對分子質(zhì)量對數(shù)成反比）（2）膠濃度（遷移率與

8、膠濃度成反比，常用0.7～1%）（3）DNA的構(gòu)象：超螺旋＞線狀分子＞開環(huán)狀分子（4）電壓（一般5V/cm,電壓與遷移率成正比)（5）堿基組成（影響不大）（6）溫度（4～30℃都可以，常室溫進(jìn)行）瓊脂糖凝膠電泳常用于DNA分析；分析RNA時需加入蛋白質(zhì)變性劑甲醛。電泳完畢用溴化乙錠（0.5μg/mL）染色，用紫外光檢測★瓊脂糖電泳用于DNA分子量的測定在同一凝膠中加入已知相對分子質(zhì)量的樣品（分子marker)，在