《疫熒光技術》PPT課件

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1、免疫熒光技術威斯騰生物技術中心威斯騰生物成立12周年慶主要內(nèi)容技術原理1實驗流程2注意事項3常見問題4免疫熒光技術(immunofluorescence)技術原理將免疫學方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標記技術結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，利用定量技術測定含量，從而可對抗原進行細胞定性和定位分析。根據(jù)實驗方法分類：直接法間接法補體法其他補體法：利用補體反應，通過形成抗原-抗體-補體復合物發(fā)射熒光。其他免疫熒光技術：時間分辨免疫熒光分

2、析熒光偏振免疫分析技術時間分辨免疫熒光測定時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。熒光偏振免疫分析技術熒光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA)是一種定量免疫分析技術，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光(525nm)。偏振熒光的強

3、弱程度與熒光分子的大小呈正相關，與其受激發(fā)時轉(zhuǎn)動的速度呈反相關。FPIA最適宜檢測小至中等分子物質(zhì)，常用于藥物、激素的測定。激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以

4、用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量,配合焦點穩(wěn)定系統(tǒng)可以實現(xiàn)長時間活細胞動態(tài)觀察。熒光顯微鏡的不足之處：1、無法實現(xiàn)對熒光、透射光的同時采集，無法實現(xiàn)多重熒光的同時采集和共定位。2、熒光的散射光太強，造成實際分辨率的大大下降。3、熒光漂白及對細胞組織的照射損傷。4、無法對樣品進行斷層掃描，完成3D的工作。5、濾鏡對熒光信號衰減大，靈敏度和熒光強度不夠。6、可以觀察活細胞和組織，但是細胞或組織內(nèi)機構(gòu)高度重疊。7、只能在二維壞境下觀察。8、樣品不能太厚。9、放大倍率小。熒光常見基礎術語：熒光物質(zhì)：某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射

5、光長的光線，即熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光物質(zhì)或熒光素。激發(fā)光：能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。熒光探針：能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI，DAPI）、標有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）。自發(fā)熒光：組織和細胞中某些成分受激發(fā)時可發(fā)出熒光，即自發(fā)熒光。漂白：熒光物質(zhì)受激發(fā)時，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失，即漂白現(xiàn)象。多激光器系統(tǒng)（多通道激光檢測）：在可見光范圍內(nèi)使用多譜線氬離子激光器，發(fā)射波長為457nm、488nm和514nm的藍綠光，氦氖綠HeNe（G）激光器提供發(fā)射波長為543nm的綠光，氦氖紅HeNe（R）

6、激光器發(fā)射波長為633nm的紅光，新的405nm的半導體激光器的出現(xiàn)可以提供近紫外譜線。目前常用于標記抗體的熒光素有以下幾種：異硫氰酸熒光(fluoresceinisothiocyanate,FITC)FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm，最大發(fā)射光波長為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色

7、。四乙基羅丹明(rhodamine,RB200)RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧?。因其熒光淬滅慢，也可用于單獨標記染色。酶作用后產(chǎn)生熒光的