資源描述：
《《疫化學(xué)技術(shù)》PPT課件》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)什么是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)ELISA的基本原理和方法ELISA的種類和變化ELISA的特點(diǎn)ELISA的應(yīng)用實(shí)例一、基本原理是利用抗原抗體進(jìn)行的檢測技術(shù)。即利用制備好的特異抗原或抗體作為試劑，以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）ELISA原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗
2、體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測定。其方法簡單，方便訊速，特異性強(qiáng)。二、酶及其底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色
3、反應(yīng).酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺 四甲替聯(lián)苯胺 氨基水楊酸 鄰聯(lián)苯甲胺2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色 黃色 棕色 蘭色 藍(lán)綠色492460449 425 642堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色 紅色400 500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色 深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光 黃色360,450 420ELISA的種類和變化（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭
4、法（四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原雙抗體夾心法（HBsAg、HBeAg等）示意圖固相載體抗體抗原酶抗體酶標(biāo)記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固
5、相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。（1）雙抗體夾心法測定抗原A.將抗體吸附于固相表面;B.加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;C.加酶標(biāo)抗體;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。雙抗原夾心法（抗-HBs等）示意圖1.將抗原包被在固相載體上。2.如
6、樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗原，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗原復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。酶抗原酶標(biāo)記抗原抗體抗原固相載體雙抗原夾心法測抗體用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法酶抗抗體酶標(biāo)記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固
7、相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。間接法（抗-HCV等）示意圖間接法測抗體傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標(biāo)本:使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定（三）競爭法此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體
8、。用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體
