《細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)》PPT課件

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1、細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)一：轉(zhuǎn)染的簡介二：轉(zhuǎn)染的分類三：轉(zhuǎn)染的方法一、轉(zhuǎn)染的簡介1.基因轉(zhuǎn)染:將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運送到細胞內(nèi)并使核酸在細胞內(nèi)維持其生物功能。2.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究。二、轉(zhuǎn)染的分類瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的快速分析為獲得穩(wěn)定表達外源基因的單細胞克隆目的DNA與宿主染色體未整合整合表達持續(xù)時間隨細胞分裂而稀釋至丟失48－72小時隨宿主細胞本身基因組一樣復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯，并被穩(wěn)定遺傳篩選辦法抗生素抗性抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染真核細胞的方法是最早應(yīng)用哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。DEAE-葡聚糖是陽離子多聚體,它與帶負電的核酸結(jié)合后接近細胞膜而被攝取。DEA

2、E一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時開始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。DEAE-葡聚糖法磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法由于試劑易得、價格便宜而被廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將DNA和氯化鈣混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細胞上，通過胞膜的內(nèi)吞作用攝人DNA。脂質(zhì)體介導(dǎo)法（目前應(yīng)用最廣泛）原理：陽離子脂質(zhì)體試劑與DNA混合后，形成一種穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層復(fù)合物，DNA被包在脂質(zhì)體中間，這種脂質(zhì)雙層復(fù)合物可直接加到培養(yǎng)的細胞中，脂質(zhì)體粘附到細胞表面并與細胞膜融合，DNA被釋放到胞漿中。此圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進入細胞的一般

3、過程?！局饕獞?yīng)用】:瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染.【特點】：使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，很大程度上應(yīng)用受限制。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。物理方法(電穿孔、顯微注射及基因槍)（1）電穿孔法利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進人的微孔

4、。電穿孔技術(shù)可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細胞，重現(xiàn)性好，但需要較多的細胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素是脈沖強度和持續(xù)時間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細胞的最佳平衡點。(2）顯微注射法該法雖然費力，但卻是非常有效的將核酸導(dǎo)人細胞或細胞核的方法。這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動物，但不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細胞的研究。（3）基因槍法該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細胞和在體的細胞。實驗室用到的轉(zhuǎn)染方法脂質(zhì)體介導(dǎo)法細胞轉(zhuǎn)染Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑：以HEK193細胞為例：轉(zhuǎn)染前一天，將細胞鋪到培養(yǎng)皿中，加入有血清無雙抗的培

5、養(yǎng)基（15ml）；24小時候換上無血清無雙抗的培養(yǎng)基12ml；將所需的質(zhì)粒用1.5ml無血清無雙抗的培養(yǎng)基稀釋；取40ul的Lipofectamine2000加入無血清無雙抗的培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5min；5min后將質(zhì)粒和Lipofectamine2000混合在一起，室溫放置20min后加入培養(yǎng)皿中，4h后換上完全培養(yǎng)基48h培養(yǎng)；注：24h看一次，如果培養(yǎng)基變顏色換培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染的影響因素細胞（1）分裂細胞相比較非分裂細胞（2）貼壁細胞相比較懸浮細胞（3）傳代次數(shù)（4）細胞數(shù)量（融合率）2交叉污染如果同一個實驗室同時培養(yǎng)不同種類的細胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴格的分

6、離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細胞系被HeLa細胞所污染。和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養(yǎng)細胞種，幾個月過后它們就會完全取代目標培養(yǎng)物。3載體DNA對純化所得的載體進行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系。在測定細胞體系的參數(shù)時，一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。（1）載體完整性（2）載體制備物4組織培養(yǎng)試劑一般原則：優(yōu)化您的細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更。(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(2)胎牛血清(3)添加劑