真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)課件.ppt

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1、真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)郝好杰將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能。其中，核酸包括DNA，反義寡核苷酸及RNAi（RNA　interference）?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因組功能研究（基因表達(dá)調(diào)控，基因功能，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物篩選研究）和基因治療研究。基因轉(zhuǎn)染的定義如何將核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞？轉(zhuǎn)染：通過(guò)生化或者物理方法將目的基　　　因?qū)胝婧思?xì)胞中。感染：通過(guò)病毒介導(dǎo)，用基因組中攜帶　　　有克隆目的片段的病毒來(lái)感染靶　　　細(xì)胞。病毒介導(dǎo)法通過(guò)病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞,之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)合成

2、DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中。以病毒為基礎(chǔ)的基因載體,是對(duì)其病毒基因組進(jìn)行操作和改造，使它攜帶外源基因和相關(guān)基因元件，并被包裝成病毒顆粒。攜帶外源基因的病毒載體被包裝成病毒顆粒就構(gòu)成了基因?qū)胂到y(tǒng)。物理方法基因槍粒子轟擊法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞,DNA在胞內(nèi)逐步釋放,表達(dá)。顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核。轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞。電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位,DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入。轉(zhuǎn)染大的基因（>65kb）。生化方法DEAE－葡聚糖法正電DEAE-

3、葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞?？梢赞D(zhuǎn)染的細(xì)胞系有限磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞。陽(yáng)離子聚合物法帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用,并通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物,然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合;另一種解釋是通過(guò)細(xì)胞是內(nèi)吞作用而被進(jìn)入細(xì)胞。特點(diǎn)可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染幾乎可以適用于所有細(xì)胞，使用方法簡(jiǎn)單,可攜帶大片段DNA,通用于各種類型的裸露DNA或RNA,能轉(zhuǎn)染

4、各種類型的細(xì)胞,沒(méi)有免疫原性。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)利用能表達(dá)綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體pEGFP-n1,在陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下,轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞系Hela細(xì)胞中，并用熒光顯微鏡觀察GFP在細(xì)胞中的表達(dá)情況。掌握基因?qū)胝婧思?xì)胞的常用的方法.陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)瞬時(shí)表達(dá)分析檢測(cè)未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達(dá)．DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1－4天內(nèi)檢測(cè)到．幾天內(nèi)，大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋；一周后就檢測(cè)不到其存在了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選要進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)分析，在轉(zhuǎn)染后４８小時(shí)低密度傳代鋪板(一般按1：8-10傳代)，給予生長(zhǎng)空間，

5、加入抗生素，在幾天或數(shù)周內(nèi)保持篩選壓力，殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈現(xiàn)克隆性生長(zhǎng)。成功的基因轉(zhuǎn)染取決于質(zhì)粒DNA的質(zhì)量必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RNA和其它化學(xué)物質(zhì)的污染，無(wú)毒素，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上經(jīng)典的CsCl梯度離心，以及轉(zhuǎn)染級(jí)的質(zhì)粒DNA純化試劑盒得到的ＤＮＡ都比較可靠．細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的最佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好，確保細(xì)胞在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期．最好在細(xì)胞未長(zhǎng)滿時(shí)轉(zhuǎn)代，并在第二天用于轉(zhuǎn)染．培養(yǎng)基中的抗生素陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加

6、了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低．所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素DNA與脂質(zhì)體的比例對(duì)于大多數(shù)陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，應(yīng)優(yōu)化DNA濃度和陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑量以得到最大的轉(zhuǎn)染效率。盡管大多數(shù)脂質(zhì)體試劑說(shuō)明書都推薦了比例，但每個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的ＤＮＡ的質(zhì)量,不同的細(xì)胞以及相同的細(xì)胞不同的生長(zhǎng)狀態(tài)可能得到的結(jié)果都會(huì)有差異．有血清時(shí)的轉(zhuǎn)染因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成，所以在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)應(yīng)不含血清，在轉(zhuǎn)染過(guò)

7、程中是可以使用血清的，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時(shí)需要進(jìn)行優(yōu)化．最好用不含血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染２－５小時(shí)后，再換用含血清的培養(yǎng)基．謝　謝??！