分子標(biāo)記(精)

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1、分子標(biāo)記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記——形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有的優(yōu)越性有：大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記揭示來自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣

2、關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。　　分子標(biāo)記的概念有廣義和狹義之分。廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義分子標(biāo)記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。理想的分子標(biāo)記必須達(dá)以下幾個要求：(1)具有高的多態(tài)性；(2)共顯性遺傳，即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；(3)能明確辨別等位基因；(4)遍布整個基因組；(5)除特殊位點的標(biāo)記外，要求分子標(biāo)記均勻分布于整個基因組；(6)選擇中性(即無基因多效性)；(7)檢測手段簡單、快速(如實驗程序易自動化)；(8)開發(fā)成本和使用成本盡量低廉；(9)在實

3、驗室內(nèi)和實驗室間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)。但是，目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均不能滿足以上所有要求。一、基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)　　　此類標(biāo)記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶解及凝膠電泳分離不同的生物DNA分子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異DNA探針與之進(jìn)行雜交，通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNA的多態(tài)性?！　　、佟∠拗菩云伍L度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)　　　1974年Grodzicker等創(chuàng)立了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)，它是一種以DNA—DNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標(biāo)記。RF

4、LP基本原理：利用特定的限制性內(nèi)切酶識別并切割不同生物個體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產(chǎn)生的DNA數(shù)目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然后與克隆DNA探針進(jìn)行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生片段在長度上差異。由于不同個體的等位基因之間堿基的替換、重排、缺失等變化導(dǎo)致限制內(nèi)切酶識別和酶切發(fā)生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。　　RFLP的等位基因其有共顯性特點。RFLP標(biāo)記位點數(shù)量不

5、受限制，通?？蓹z測到的基因座位數(shù)為1—4個。RFLP技術(shù)也存在一些缺陷，主要是克隆可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難；另外，實驗操作較繁鎖，檢測周期長，成本費用也很高。自RFLP問世以來，已經(jīng)在基因定位及分型、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、疾病的基因診斷等研究中仍得到了廣泛的應(yīng)用。　?、凇?shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)　　　數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列又稱小衛(wèi)星DNA(MinisatelliteDNA)，是一種重復(fù)DNA小序列，為10到幾百核苷酸，拷貝數(shù)10一10001不等。VNTR基本原理與RFLP大

6、致相同，只是對限制性內(nèi)切酶和DNA探針有特殊要求：(1)限制性內(nèi)切酶的酶切位點必須不在重復(fù)序列中，以保證小衛(wèi)星或微衛(wèi)星序列的完整性。(2)內(nèi)切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點，則可使衛(wèi)星序列所在片段含有較少無關(guān)序列，通過電泳可充分顯示不同長度重復(fù)序列片段的多態(tài)性。(3)分子雜交所用DNA探針核昔酸序列必須是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列，通過分子雜交和放射自顯影后，就可一次性檢測到眾多小衛(wèi)星或微衛(wèi)星位點，得到個體特異性的DNA指紋圖譜?！　⌒⌒l(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)信息含量較高，在17一19之間。缺點是數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻，這就極大限制其在基因定位中的應(yīng)

7、用。VNTR也存在實驗操作繁瑣、檢測時間長、成本高的缺點?！　　《?、基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)　　?。ㄒ唬?、隨機(jī)引物的PCR標(biāo)記　　所用引物的核苷酸序列是隨機(jī)的，其擴(kuò)增的DNA區(qū)域事先未知。隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增的DNA區(qū)段產(chǎn)生多態(tài)性的分子基礎(chǔ)是模板DNA擴(kuò)增區(qū)段上引物結(jié)合位點的堿基序列的突變，不同來源的基因組在該區(qū)段上表現(xiàn)為擴(kuò)增產(chǎn)物有無差異或擴(kuò)增片段大小的差異。隨機(jī)引物PCR標(biāo)記表現(xiàn)為顯性或共顯性。　?、佟‰S機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD)　　RAPD技術(shù)是1990年由Wiliam和Welsh

8、等人利用PCR技術(shù)發(fā)展的檢測DNA多態(tài)性的方法?；驹恚核抢秒S機(jī)引物（一般為8—10bp