熒光定量PCR中探針?lè)ㄅc染料法的區(qū)別

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1、熒光定量PCR中探針?lè)ㄅc染料法的區(qū)別：　　一、熒光定量PCR中探針?lè)ㄅc染料法的描述：　　1.熒光定量PCR探針?lè)ǎ禾结樂(lè)闯艘锿饬硗庠O(shè)置一個(gè)探針，在探針的兩端分別帶上發(fā)光集團(tuán)和淬滅集團(tuán)，這個(gè)時(shí)候，兩個(gè)平衡不發(fā)光，但是當(dāng)DNA通過(guò)引物合成的時(shí)候，探針被折斷，釋放出發(fā)光集團(tuán)和淬滅集團(tuán)，兩個(gè)距離較遠(yuǎn)，發(fā)光集團(tuán)產(chǎn)生熒光，被機(jī)器收集到信號(hào)，從而檢測(cè)基因的量　　2、熒光定量PCRSYBRGreen染料法：染料能夠與雙鏈結(jié)合，當(dāng)PCR擴(kuò)增的時(shí)候，染料結(jié)合到DNA上，從而發(fā)光，單個(gè)的染料不發(fā)光，這樣就能收集到信號(hào)

2、，我們可以看出，染料法特異性不強(qiáng)，只要是雙鏈的DNA都回結(jié)合發(fā)光?！　《晒舛縋CR中探針?lè)ㄅc染料法的優(yōu)缺點(diǎn)　　1、探針?lè)ㄍㄟ^(guò)探針可以增加反應(yīng)收集信號(hào)的特異性，只有探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴(kuò)增才能收集到信號(hào)，能夠用多重體系反應(yīng)的方法，能夠預(yù)測(cè)和提前進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，缺點(diǎn)是要合成探針，成本高　　2、染料法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，可以做溶解曲線，分析全部PCR產(chǎn)物的TM值，缺點(diǎn)就是特異性沒(méi)有探針?lè)ê谩痉窒怼慷縫cr儀選則寶典:各自精彩的選擇　　如何選擇合適的定量PCR儀定量PCR儀主要由兩部分組成，一個(gè)是PCR系統(tǒng)

3、，一個(gè)是熒光檢測(cè)系統(tǒng)。選擇定量PCR儀的關(guān)鍵——由于定量PCR必需借助樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對(duì)比來(lái)實(shí)現(xiàn)定量的，對(duì)于定量PCR系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，重要的參數(shù)除了傳統(tǒng)PCR的溫控精確性、升降溫速度等等，更重要的還在于樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數(shù)級(jí)放大。至于熒光檢測(cè)系統(tǒng)，多色多通道檢測(cè)是當(dāng)今的主流趨勢(shì)——儀器的激發(fā)通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬;多通道指可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣品中的多種熒光，儀器就可以同時(shí)檢測(cè)單管內(nèi)多模版或者內(nèi)標(biāo)+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更強(qiáng)大。熒光檢測(cè)系統(tǒng)

4、主要包括激發(fā)光源和檢測(cè)器。激發(fā)光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發(fā)光二極管LED光源，前者可配多色濾光鏡實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長(zhǎng)，而單色發(fā)光二極管LED價(jià)格低、能耗少、壽命長(zhǎng)，不過(guò)因?yàn)槭菃紊枰煌腖ED才能更好地實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長(zhǎng)。監(jiān)測(cè)系統(tǒng)有超低溫CCD成像系統(tǒng)和PMT光電倍增管，前者可以一次對(duì)多點(diǎn)成像，后者靈敏度高但一次只能掃描一個(gè)樣品，需要通過(guò)逐個(gè)掃描實(shí)現(xiàn)多樣品檢測(cè)，對(duì)于大量樣品來(lái)說(shuō)需要較長(zhǎng)的時(shí)間。定量PCR儀需要考慮的另外一個(gè)因素是軟件設(shè)計(jì)，這一點(diǎn)目前較新型號(hào)的儀器都有不錯(cuò)的配套軟件可以滿足常規(guī)使用。

5、——隨著定量PCR技術(shù)在臨床診斷、疾病監(jiān)控、藥物監(jiān)測(cè)、腫瘤研究等領(lǐng)域的越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，市面上不同品牌和設(shè)計(jì)的定量PCR儀也不斷推陳出新，生物通在這里著重介紹不同的3類定量PCR儀，各有各精彩?！　?.傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀以美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)為代表。傳統(tǒng)96孔板式定量PCR儀的優(yōu)點(diǎn)是可容納的樣本量大而且無(wú)需特殊耗材，可以采用傳統(tǒng)的96孔板甚至384孔板進(jìn)行批量的定量反應(yīng)，但是缺點(diǎn)也顯而易見(jiàn)——溫度均一性不佳——平板固定加熱模塊的PCR溫度控制有邊緣效應(yīng)—

6、—樣品槽上每個(gè)孔之間的溫度存在差異——也就是所謂位置效應(yīng)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件應(yīng)難以做到與樣本完全一致，樣本和樣本之間的溫度控制也可能存在差異，對(duì)于靈敏度極高的定量PCR來(lái)說(shuō)，任何極微小的差異都會(huì)以指數(shù)級(jí)別的規(guī)模被放大，不能不說(shuō)是一種缺憾。傳統(tǒng)反應(yīng)板面積大，溫度控制的精確性、升降溫速度也相對(duì)較慢，因而反應(yīng)速度也較慢。96孔板定量PCR儀的熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)，由于96孔板上樣品孔的位置是固定的，每個(gè)樣品孔距離光源和監(jiān)測(cè)器的光程各不相同，有可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。檢測(cè)在試管管底進(jìn)行，試管底的透光性和厚薄均一性

7、都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。MJ和Bio-Red公司的定量PCR儀也屬于這一類。ABI的7500型熒光定量PCR儀激發(fā)光源為鹵鎢燈光源，5色濾光鏡，可同時(shí)激發(fā)96個(gè)樣品，超低溫CCD具備同時(shí)多點(diǎn)多色檢測(cè)的能力，能夠有效地分辨FAM/SYBRGreenI,VIC/JOE,NED/TAMRA/Cy3,ROX/TexasRed,和Cy5等熒光染料。多色熒光檢測(cè)技術(shù)為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照的陰/陽(yáng)性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本

8、。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)軟件PrimerExpress非常有用，“因?yàn)榈侥壳盀橹惯€沒(méi)有其他軟件有能力設(shè)計(jì)定量PCR所需的TaqMan探針(生物通摘自ABI技術(shù)資料)”。各型號(hào)都有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)(Real-Time)和終點(diǎn)讀板(PlateRead)兩種運(yùn)行模式。實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)模式用于定量DNA或RNA拷貝數(shù)。可以動(dòng)態(tài)顯示PCR擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大于9個(gè)數(shù)量級(jí)，區(qū)分5000和10000個(gè)拷貝的DNA模板可信度達(dá)99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒