固定化酶與固定化細(xì)胞1

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1、第四章　固定化酶與固定化細(xì)胞本章內(nèi)容酶的固定化(1)為什么要固定化?(2)怎樣固定化?(固定化方法)(3)固定化酶的特性細(xì)胞的固定化(1)細(xì)胞固定化所用的方法(2)固定化細(xì)胞的特性輔酶的固定化什么是固定化酶？指固定在一定載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。一酶的固定化直接利用微生物酶——（1）不穩(wěn)定。在高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿下。（2）易失活。即使在最適合的條件下反應(yīng)。（3）回收困難。用適當(dāng)方法提取目的產(chǎn)物后，殘存酶回收困難。（4）反應(yīng)速度減慢。不容易和毒副分子和產(chǎn)物分離.（5）經(jīng)濟(jì)上不合算。一次性反應(yīng)后不能再次使用。阻礙了微生物酶的應(yīng)用和發(fā)展。

2、研制固定化酶和固定化菌體(一)為什么要固定化?(一)為什么要固定化?在一定程度上可以改善酶的穩(wěn)定性；可以多次反復(fù)使用，有利于采用連續(xù)操作工藝，從而使酶和細(xì)胞的使用率提高，降低生產(chǎn)成本；酶和細(xì)胞不混入產(chǎn)物，可精簡(jiǎn)產(chǎn)物分離工序。(1)固定化在一定程度上可以改善酶的穩(wěn)定性固定化增加了酶的耐熱性（熱變性原理）固定化增加了酶對(duì)蛋白變性劑（尿素，鹽酸胍）等的抵抗能力固定化減少了蛋白酶的作用（阻礙了活性部位的接近）(2)固定化使酶和細(xì)胞的使用率提高江南大學(xué)的孫志浩通過(guò)卡拉膠包埋的方法，使酶的重復(fù)利用30個(gè)批次后活性沒(méi)有明顯減少，大大促進(jìn)了酶的利用率，加速了工藝工業(yè)

3、化進(jìn)程．(3)可精簡(jiǎn)產(chǎn)物分離工序底物和產(chǎn)物更容易和酶分離(二)怎樣固定化?(固定化方法)固定化的第五種方法　變性法在不使用載體的情況下，借助加熱、冰凍或β-射線等物理手段，也可通過(guò)添加檸檬酸、各種絮凝劑、交聯(lián)劑或變性劑處理，使細(xì)胞內(nèi)起破壞作用的蛋白酶變性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定和菌體聚集成大顆粒達(dá)到固定化的目的。此法制備的細(xì)胞一般只用于完成單酶或少數(shù)幾種酶催化反應(yīng)。(1)吸附法物理吸附是通過(guò)氫鍵、疏水鍵和π電子親和力等物理作用力將酶固定于不溶性載體的方法。常用的載體有高嶺土、皂土、硅膠、磷酸鈣膠、氧化鋁、微孔玻璃等無(wú)機(jī)吸附劑離子交換吸附是在適宜的pH和離子強(qiáng)度

4、條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換劑的相互作用而達(dá)到固定化的一種方法。最常用的交換劑有CM－纖維素、DEAE－纖維素、DEAE－葡聚糖凝膠等。蛋白質(zhì)濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。pH：影響載體和酶的電荷變化,從而影響酶吸附。離子強(qiáng)度：多方面的影響，一般認(rèn)為鹽阻止吸附。溫度：蛋白質(zhì)往往是隨溫度上升而減少吸附。載體：蛋白質(zhì)在固體載體上的吸附速度要比小分子慢得同時(shí)對(duì)于非多孔性載體，則顆粒越小吸附力越強(qiáng)。多孔性載體，要考慮吸附對(duì)象的大小和總吸附面積的大小。影響酶蛋白在載體上吸附程度的因素吸附法特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，處理?xiàng)l

5、件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心不易破壞，有利于制備高活性酶缺點(diǎn)：載體與酶的結(jié)合力較弱，在高離子強(qiáng)度下酶易從載體上脫落吸附法（制備的工藝）水相固定化法這是最常見(jiàn)的吸附固定化方法，即將酶溶解于緩沖液中，加入載體，振蕩或攪拌一定時(shí)間后，抽濾、洗滌、冷凍干燥即可得固定化酶載體表面涂布法將酶溶入少量緩沖液中，加入載體，混合均勻，冷凍干燥可得固定化酶。此法相當(dāng)于直接將酶涂布于載體上，避免了水相固定化中酶的大量流失溶劑沉淀法即在低溫下向含有載體的脂肪酶液中加入酶的有機(jī)溶劑作沉淀劑(如丙酮)使酶析出，沉淀在載體表面。此法所得固定化酶酶活性較高，載體性質(zhì)對(duì)固定化無(wú)明顯

6、影響，但酶在載體表面分布不均勻吸附法（制備的工藝）游離固定化法將具有一定親水性的載體分散于疏水溶劑中，另將酶粉溶入少量緩沖液的酶液加入，振蕩可攪拌一定時(shí)間后，便得固定化酶。其原理是：親水性載體可在其表面形成一層水膜，酶分子不溶于溶劑，只能存在于這層水膜中，因而可以完全被固定化微晶體法將可結(jié)晶的物質(zhì)和酶溶液混合在一起，然后滴入親水有機(jī)溶劑中，當(dāng)可結(jié)晶物質(zhì)結(jié)晶析出時(shí)，酶就有規(guī)則吸附在晶體表面上電沉積法。在酶溶液中放置兩個(gè)電極，在電極臨近加入載體，通電后，酶移向電極，并沉積到載體表面的固定化方法。采用這種方法時(shí)需事先確定載體和酶在電場(chǎng)中是否會(huì)分解和失活。在

7、沉積過(guò)程中和酶活性、穩(wěn)定性有關(guān)的某些離子如果發(fā)生移除、損漏，那么就必須即時(shí)補(bǔ)充、替代。(2)共價(jià)結(jié)合法借助共價(jià)鍵將酶的活性非必須側(cè)鏈基團(tuán)或細(xì)胞表面基團(tuán)（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基等）和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)以達(dá)到固定化目的方法。此法得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用，因此它是目前應(yīng)用最多的一類固定化酶的方法。共價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)：得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用。共價(jià)偶聯(lián)法的缺點(diǎn)：載體活化的操作復(fù)雜，反應(yīng)條件激烈，需要嚴(yán)格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時(shí)共價(jià)結(jié)合會(huì)影響到酶的空間構(gòu)象，從而對(duì)酶的催化活性產(chǎn)生影響。共

8、價(jià)偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)共價(jià)結(jié)合法example纖維素+鹽酸甲醇CMC－甲酯＋肼CMC－酰肼CMC－疊氮化物＋N