固定化酶與固定化細(xì)胞.ppt

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1、本章講授①固定化生物催化劑的概念以及吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、無(wú)載體固定化酶的基本技術(shù)和原理；②細(xì)胞固定化的基本技術(shù)和原理；③簡(jiǎn)要介紹固定化酶基本性質(zhì)的影響及輔因子的固定化方法和輔酶的再生體系。121.酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機(jī)溶劑對(duì)其有影響）。2.不能回收，使用成本高。3.酶在游離體系中更容易自水解4.分離純化困難，也使產(chǎn)物中混雜酶蛋白游離酶的缺點(diǎn)：3固定化酶（定義）：用物理或化學(xué)手段定位在限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性，可重復(fù)利用的酶。（1971年在美國(guó)召開(kāi)的第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議）固定化細(xì)胞（定義）：將具有一定生理功能的生物細(xì)胞（如微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)

2、物細(xì)胞等），用一定的方法將其固定，作為固體生物催化劑而加以利用的一門(mén)技術(shù)。固定化細(xì)胞意義：用完整的細(xì)胞作為生物催化劑，以充分有效地利用生物細(xì)胞內(nèi)的特定酶或多酶系統(tǒng)。4優(yōu)點(diǎn)①省去對(duì)酶的提取過(guò)程，使酶的損失和生產(chǎn)成本降到最低程度；②可以利用細(xì)胞的多酶系統(tǒng)直接生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)物。5第一節(jié)酶和細(xì)胞的固定化一、固定化酶和細(xì)胞的定義及特點(diǎn)二、固定化方法三細(xì)胞的固定化方法四原生質(zhì)體的固定化方法6一、固定化酶和細(xì)胞的定義及特點(diǎn)1.固定化酶(immobilizedenzyme)通過(guò)化學(xué)或物理的手段將酶定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用。7什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性

3、酶（固定化酶）固定化技術(shù)8酶固定化方法要求①不破壞酶活性中心的構(gòu)象：酶的固定化不能破壞酶活性中心的構(gòu)象，盡量防止活性部位的氨基酸殘基受到影響；②載體要求：a.固定化的載體應(yīng)與酶結(jié)合較為牢固。B.載體不能與底物、產(chǎn)物等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。C.載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，防止因機(jī)械攪拌而破碎。③位阻應(yīng)該較?。罕M可能不妨礙酶與底物的接近。④成本低：酶固定化的成本要盡可能的低。9優(yōu)點(diǎn)：(1)可提高穩(wěn)定性。(2)能回收，易與產(chǎn)物分離，可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：(1)存在擴(kuò)散限制。適于催化小分子物質(zhì)。(2)酶活性下降。102.固定化細(xì)胞（immobilizedcell）固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行

4、生命活動(dòng)（生長(zhǎng)、繁殖、新陳代謝）的細(xì)胞。11優(yōu)越性：(1)降低成本，省去酶的分離純化工作;(2)既可作為單一酶，也可作為復(fù)合酶系完成部分代謝過(guò)程。局限性：(1)細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物。(2)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用。123.固定化原生質(zhì)體意義：(1)固定化原生質(zhì)體去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，有利于氧的傳遞，營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。(2)原生質(zhì)體不穩(wěn)定，容易破裂，固定化后，由于載體的保護(hù)作用，穩(wěn)定性提高。13二、固定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法吸附法共價(jià)偶聯(lián)法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型離子交換吸附物理吸附法14依據(jù)帶電的酶或細(xì)胞和載體

5、之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交換劑上。1.吸附法（adsorption）15根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)分:1）物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素等。2）離子結(jié)合法（ionbinding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素16優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，操作簡(jiǎn)便，酶活力損失少。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。17借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。2.共價(jià)偶聯(lián)法（covalentbindingorcovalentcoup

6、ling）181）載體：親水載體優(yōu)于疏水載體如:天然高分子衍生物:纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機(jī)械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺聚苯乙烯機(jī)械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)尼龍192）偶聯(lián)方法：偶聯(lián)成功與否取決于：載體：功能基團(tuán)：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:側(cè)鏈非必需基團(tuán)：羧基，巰基，羥基，酚基，咪唑基。20常用的偶聯(lián)反應(yīng)有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。21優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。223.交聯(lián)法（crosslinking）借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。雙功能試劑：常

7、用的是戊二醛OOH—C—CH2—CH2—CH2—C—H23戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。此法與共價(jià)偶聯(lián)法利用的均是共價(jià)鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。24交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。酶濃度低時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。酶濃度高時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。25缺點(diǎn)：(1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。264.包埋法（entrapment）將酶用物理的方法包埋在各種載體（