土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)

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1、課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)課題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O1、實(shí)例：?jiǎn)⑹荆簩ふ夷康木N時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件。原因：因?yàn)闊崛獪囟?0～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930

2、C）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO42、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①?gòu)奈锢硇再|(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？固體培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖唯一氮源：尿素選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基的唯一氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解利用尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。3、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理選擇培養(yǎng)基：

3、在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。（1）將土壤中的固氮菌分離出來(lái)（2）將土壤中自養(yǎng)微生物分離出來(lái)舉一反三（3）篩選出抗青霉素的微生物（4）篩選出耐高濃度食鹽的微生物……1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)特定的面積（1mm2）和高（0.1mm）的計(jì)數(shù)室，在1mm2的面積里又被劃分成25個(gè)（或16個(gè)）中格，每個(gè)中格進(jìn)一步劃分成16個(gè)（或者25個(gè)）小格，但計(jì)數(shù)室都是由400個(gè)小格組成。計(jì)數(shù)室②操作：

4、將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再將稀釋的樣品滴在計(jì)數(shù)板上，然后在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)4～5個(gè)中格中的細(xì)菌數(shù)，并求出每個(gè)小格所含細(xì)菌的平均數(shù)，再按下面公式求出每毫升樣品中所含的細(xì)菌數(shù)。③計(jì)算公式：每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)。1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)：2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）（1）常用方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，

5、C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。（2）原理：稀釋涂布平板法。說(shuō)明設(shè)置重復(fù)組的重要性。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)

6、。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了被測(cè)試的條件外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)。滿足條件的是對(duì)照組，未滿足條件的是實(shí)驗(yàn)組。㈢.設(shè)置對(duì)照：判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染：將未接種的培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：完全培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基）與選擇培養(yǎng)基接種后培養(yǎng)觀察菌落數(shù)目。小結(jié)：對(duì)照組雖然不直接影響結(jié)果，但實(shí)驗(yàn)結(jié)論要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)

7、置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。二.實(shí)驗(yàn)的具體操作㈠.土壤取樣從富含有機(jī)物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。◆在稀釋土壤溶液的過(guò)

8、程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同，一般，細(xì)菌>放線菌>真菌。目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板。