外源基因的表達1

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1、第七章外源基因的表達第一節(jié)外源基因在原核細胞中的表達1.原核生物基因表達的特點與真核細胞相比，原核細胞的基因表達有以下特點：（1）原核生物只有一種RNA聚合酶（真核細胞有三種）識別原核細胞的啟動子，催化所有RNA的合成。（2）原核生物的基因表達是以操縱子為單位的。（3）由于原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進行的。（4）原核基因一般不含有內(nèi)含子，在原核細胞中缺乏真核細胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。（5）原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物的直接控制要慢。（6）在大腸桿菌mRNA的核糖體結合位點上，含有一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子及1

2、6S核糖體RNA3’末端堿基互補的序列，即S-D序列，而真核基因則缺乏此序列。2.原核表達系統(tǒng)的注意事項從上述特點可以看出，欲將外源基因在原核細胞中表達，必須考慮表達載體、外源基因的性質(zhì)、原核細胞的啟動子和S-D序列、閱讀框架及宿主菌調(diào)控系統(tǒng)等基本條件，也就是說必須滿足以下條件：（1）通過表達載體將外源基因?qū)胨拗骶⒅笇拗骶拿赶到y(tǒng)合成外源蛋白。（2）外源基因不能帶有內(nèi)含子，因而必須用cDNA或化學合成的基因，而不能用基因組DNA。（3）必須利用原核細胞的強啟動子和S-D序列等調(diào)控元件控制外源基的表達。（4）外源基因與表達載體連接后，必須形

3、成正確的開放閱讀框架。（5）利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達，防止外源基因的表達產(chǎn)物對宿主菌的傷害。3.原核生物基因表達的調(diào)控序列只有在了解了原核生物基因表達調(diào)控序列的基礎上，才能夠構建高效的表達載體，使外源目的基因在原核細胞中得到高效率、高水平地表達。對于原核細胞來講，基因表達的調(diào)控序列主要涉及啟動子、S-D序列、終止子、增強子、衰減子等序列。（1）啟動子啟動子(promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調(diào)控序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。原核生物的啟動子是由兩段彼此分

4、開且高度保守的核苷酸序列組成。■-35區(qū)（TTGACA）：位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的-35bp附近，是RNA聚合酶初始識別和結合位點?！?10區(qū)（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶結合于此處導致DNA雙鏈形成單鏈。原核表達系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的強啟動子有l(wèi)ac（乳糖啟動子）、trp（色氨酸啟動子）、PL及PR（λ噬菌體左向和右向啟動子）、tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子）等。（2）終止子在一個基因或一個操縱子的3’端往往有一個特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一段DNA序列稱為終止子（terminator)。終止子在結構上有一些共

5、同的特點，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C區(qū)域具有回文對稱結構，使轉(zhuǎn)錄后的RNA具有莖環(huán)結構。根據(jù)轉(zhuǎn)錄終止作用類型，終止子可分為兩種：依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止子及不依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止子。（3）S-D序列S-D序列是位于起始密碼子（AUG）上游3~10bp處的由3~9bp組成的序列。這段序列正好與16SrRNA3’端序列互補，是rRNA的識別和結合位點。S-D序列存在與否及S-D序列與起始密碼子之間的距離，是影響mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的主要因素之一。（4）增強子增強子（enhancer)是能夠增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用

6、序列。4.幾種類型的原核表達載體在原核細胞中表達外源基因時，由于實驗設計的不同，總的來說可以產(chǎn)生融合型和非融合型表達蛋白。不與細菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達蛋白稱為非融合蛋白。融合蛋白指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。（1）非融合型表達蛋白載體pKK223-3具有一個強的tac（trp-lac）啟動子，這個啟動子是由trp啟動子的-35區(qū)、lacUV5啟動子的-10區(qū)、操縱基因及S-D序列組成。緊接著tac啟動子的是一個取自pUC8的多位點接頭，使之很容易把目的基因定位在啟動子和S-D序列

7、之后。在多位點下游的一段DNA序列中，還包含一個很強的rrnB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。載體的其余部分由pBR322組成。（2）分泌型克隆表達載體pINIII系統(tǒng)這個載體系統(tǒng)是由pBR322為基礎構建的。帶有大腸桿菌最強的啟動子之一，即Ipp（脂蛋白基因）啟動子。在啟動子的下游裝有l(wèi)acUV5的啟動子及其操縱基因，并把lac阻遏子的基因（lacI）也克隆到這個質(zhì)粒上。這樣目的基因的表達就成為可調(diào)節(jié)的了。在轉(zhuǎn)錄控制的下游再裝上人工合成的高效翻譯起始序列（S-D序列及ATG）。信號肽序列取自于大腸桿菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜蛋白基因）。在編碼序

8、列的下游緊接著一段人工合成的多克隆位點片斷，包括三個單一酶切位點，EcoRI、HindIII、BamHI。（3）融合蛋白表達載體pGEX