第6章 外源基因的表達(dá)

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1、第六章外源基因的表達(dá)基因表達(dá)技術(shù)是基因工程的核心技術(shù)之一．外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)環(huán)節(jié)，它是在一系列酶蛋白和調(diào)控序列的共同作用下完成的．＊　原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)＊　酵母基因表達(dá)系統(tǒng)＊　植物基因表達(dá)系統(tǒng)＊　動物基因表達(dá)系統(tǒng)第一節(jié)基因表達(dá)機(jī)理外源基因的起始轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟.選擇可調(diào)控的啟動子和相關(guān)的調(diào)控序列.啟動子在細(xì)胞生長的初期不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定的密度后開始高效表達(dá)．原核生物基因表達(dá)的啟動子一般比較簡單，可分為兩大類：誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子，前者如lac、

2、trp、λPR、λPL、tac等的啟動子，后者如T7噬菌體的啟動子．外源基因在真核生物中的起始轉(zhuǎn)錄和表達(dá)相對復(fù)雜，啟動子和增強(qiáng)子序列是外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)所必需的．真核生物基因表達(dá)的啟動子也可分為誘導(dǎo)型和組成型等類型.2mRNA的延伸與穩(wěn)定性1)mRNA的延伸衰減子位點(diǎn)（attenuators）：類似于簡單的終止　子，在原核生物中一般位于操縱子的啟動子與第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之間．在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)要盡量避免該序列的存在．抗終止的序列元件（antitermination）．Poly(A)摻入信號序列：AAUAAA2)mRNA

3、的穩(wěn)定性mRNA的穩(wěn)定性直接決定翻譯產(chǎn)物的多少．對原核細(xì)　胞來說，最佳的方法是選擇一個(gè)RNase缺失的受體　　菌．對真核細(xì)胞來說，則需要考慮增加mRNA的正確　加工，提高成熟mRNA的穩(wěn)定性．3外源基因mRNA的有效翻譯1)原核生物外源基因mRNA有效翻譯基本原則*AUG（ATG）是首選的起始密碼子．*SD序列為與核糖體16SrRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有AGGAGG序列中的的4個(gè)堿基．*SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為3?9個(gè)堿基．*在翻譯起始區(qū)周圍的序列不易形成明顯的二級結(jié)構(gòu)．2)真核生物基因mRNA有

4、效翻譯非翻譯區(qū)不存在SD序列，但絕大多數(shù)mRNA的起始序列都含有共同的序列5'-CCA（G）CCATGG-3'，如果改變這一序列，可使翻譯的起始效率大大降低．4表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性外源基因的表達(dá)產(chǎn)物能否在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定積累而不被內(nèi)源蛋白水解酶所水解是基因有效表達(dá)的一個(gè)重要因素．蛋白質(zhì)水解是一個(gè)有選擇的、精細(xì)調(diào)控的過程，它會影響外源基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的積累．＊　構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)．＊　構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)．＊　構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)．＊　選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)5目的基因沉默基因沉默（genesilenci

5、ng）是導(dǎo)致外源基因不能正常表達(dá)的重要因素．位置效應(yīng)基因沉默：基因在基因組中的位置對其表達(dá)的影響．在植物和動物轉(zhuǎn)基因中，外源基因進(jìn)入細(xì)胞核中并整合到染色體DNA上，其整合的位點(diǎn)與基因的表達(dá)密切相關(guān)．轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：在DNA水平上的基因調(diào)控，主要是由于啟動子的甲基化或外源基因的異染色質(zhì)化而引起的．轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：在RNA水平上的基因調(diào)控，比轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默更普遍．共抑制(cosuppression)是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默的一種，指被整合的外源基因沉默的同時(shí)，與其同源的內(nèi)源DNA的表達(dá)也受到抑制．第二節(jié)基因表達(dá)

6、的調(diào)控元件1啟動子啟動子（promoter）是一段提供RNA聚合酶識別和結(jié)合的DNA序列，它位于基因的上游．其長度因生物的種類而異，一般不超過200bp．一旦RNA聚合酶定位并結(jié)合到啟動子序列上，即可啟動轉(zhuǎn)錄．啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件．啟動子特性序列特異性．在啟動子的DNA序列中，通常含有幾個(gè)保守的序列框，序列框中堿基的變化會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄啟動的滯后和轉(zhuǎn)錄速度的減慢．方向性．啟動子是一種有方向性的順式調(diào)控元件，在正反兩種方向中只有一種具有啟動功能．位置特性．啟動子只能位于所啟動轉(zhuǎn)錄基因的上游或基因內(nèi)的前端，處于基因

7、的下游或在基因的上游但離所要啟動的基因太遠(yuǎn)，一般都不會起作用．種屬特異性．原核生物的不同種、屬，真核生物的不同組織都具有不同類型的啟動子．原核生物啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。多數(shù)細(xì)菌啟動子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)序列為CAT．Pribnow框。在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游6bp處存在一個(gè)六聯(lián)　體保守序列：TATAAT，由于中間的堿基位于轉(zhuǎn)錄的起始　點(diǎn)上游的10bp處，又稱為-10序列區(qū)。少數(shù)Pribnow框　中間堿基的位置在-9?-18之間變化。Sextama框。在轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的另一個(gè)六聯(lián)體保守序列位　于距轉(zhuǎn)錄起　始位點(diǎn)上游35bp處，通常稱為-35

8、區(qū)，該　保守序列為TTGACA，它是RNA聚合酶的識別位點(diǎn)。間隔區(qū)。間隔序列內(nèi)部無明顯的保守性，其序列的堿基　組成對啟動子的功能并不十分重要。但間隔序列的長　　度卻是影響啟動子功能．真核生物啟動子I型啟動子。I型啟動子所屬基因編碼的產(chǎn)物為rRNA前體，經(jīng)剪切加工后成為各種成熟的rRNA分子。Ⅱ型啟動子。Ⅱ型啟動子所屬的基因絕大多數(shù)