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《實(shí)驗(yàn)九質(zhì)粒DNA的制備》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實(shí)驗(yàn)四堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘百|(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體。質(zhì)粒類型質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：1.松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時(shí)，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)2000-3000拷貝。2.嚴(yán)緊型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制需要一個(gè)質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過用氯霉素等蛋白合成抑制劑來增加。質(zhì)粒的應(yīng)用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來
2、表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。分離質(zhì)粒DNA方法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的堿變性法；煮沸法；SDS法；羥基磷灰石層析法等各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)要求掌握最常用的質(zhì)粒的提取方法。堿變性法基本原理在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調(diào)至中
3、性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。試劑溶液Ⅰ：25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鮮配制）0.2NNaOH1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml(酚/氯仿)，異丙醇,乙醇RNase瓊脂糖ＴＥ：10mMTris-HCl(pH8.0)1mMEDTApUC19鏈長2,686bp多克隆位點(diǎn)：EcoRI,SacI
4、,KpnI,SmaI,BamHI,XbaI,SalI,PstI,SphI和HindIII只有一個(gè)酶切位點(diǎn)。用途克隆外源基因。利用lacpromoter進(jìn)行基因表達(dá)。使用M13primers進(jìn)行DNA測序。三．實(shí)驗(yàn)方法1.挑單克隆E.coli菌株接種到培養(yǎng)基上（活化菌種），37℃過夜培養(yǎng)2.從培養(yǎng)基上挑E.coli菌株，接種于25毫升液體培養(yǎng)液內(nèi)（含氨芐），37℃振蕩過夜培養(yǎng)3.從中取4毫升種子菌液于LB培養(yǎng)基中（含Amp），37℃振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)一細(xì)菌培養(yǎng)與質(zhì)粒擴(kuò)增二質(zhì)粒提取1.取1ml培養(yǎng)物倒入Eppendorf管中，4000-5000r/min，5min2.吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡
5、可能干燥3.將細(xì)菌沉淀懸浮于150μl溶液Ⅰ中，振蕩混勻。4.加入150μl溶液Ⅱ，蓋嚴(yán)管蓋輕柔顛倒５次以混勻內(nèi)容物，室溫放置5分鐘。5.立即加入150μl溶液Ⅲ，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置５分鐘。6.12000r4℃離心10分鐘，取上清移到１個(gè)新的Eppendorf管中。7．加入等體積異丙醇，振蕩混勻，于室溫靜置5分鐘,12000r4℃離心15分鐘。8．棄上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴(yán)管蓋顛倒數(shù)次，8000r于離心5分鐘。9．棄上清，抽干乙醇，室溫干燥（5-15分鐘）。10．加入20μlTE（含20μg/mlRNA酶，不含DNA酶）溶解DNA。問題與討論：１．簡要敘述溶液Ⅰ、溶液
6、Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及實(shí)驗(yàn)中分別加入上述溶液后，反應(yīng)體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。２．染色體DNA與質(zhì)粒DNA分離的主要依據(jù)是什么？3.沉淀ＤＮＡ?xí)r為什么要用無水乙醇及在高鹽、低溫條件下進(jìn)行？
