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《實驗六質(zhì)粒dna的制備》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實驗六堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA一．實驗目的掌握堿變性裂解法制備質(zhì)粒DNA的原理。掌握DNA分離純化的基本操作技能。二．實驗背景質(zhì)粒是細菌染色體外的環(huán)形雙鏈DNA分子，能在宿主細胞內(nèi)獨立自主的進行復制。大多數(shù)來自細菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細菌內(nèi)的共生型遺傳因子。大小可從1kb到200kb。TheconstructedE.coliplasmidpBR322.質(zhì)粒的復制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性或致育因子等。Relaxedcircl
2、eLinearizedformSuper-coiledform質(zhì)粒類型質(zhì)粒按復制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒和嚴緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒其復制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。質(zhì)粒的拷貝數(shù)通常很高，有的甚至可達2000-3000拷貝/細胞。2.嚴緊型質(zhì)粒嚴緊型質(zhì)粒的復制受到嚴格控制，其拷貝數(shù)通常很低，每個細胞內(nèi)只含有1個或幾個質(zhì)粒分子。質(zhì)粒的應用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴緊型質(zhì)粒用來表達一些可使宿主細胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值。-四個載體酶切圖分離質(zhì)粒DN
3、A方法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的有：堿變性法；煮沸法；羥基磷灰石層析法等各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。差速離心（differentialcentrifugation）是利用不同離心速度產(chǎn)生的不同離心力，將沉降系數(shù)不同的各種亞細胞組分和各種顆粒分開。用于分離大小、形狀顯著不同的組分，根據(jù)顆粒沉降速度不同得以分離.特點：（1）介質(zhì)密度均一；（2）速度由低向高，逐級離心。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體——核蛋白體?？蓪⒋笮∠?/p>
4、差懸殊的細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯度離心再行分離純化。差速離心dx2r2(ρp-ρm)V==.ω2Xdt9ηd2(ρp-ρm)=.ω2X18ηr：球形粒子的半徑d：球形粒子的直徑η：流體介質(zhì)的粘度數(shù)ρp：粒子的密度ρm：介質(zhì)的密度沉降系數(shù)Sedimentationcoefficient(S)S在實際應用時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。S是指單位離心場中粒子移動的速度。差速離心高速低速三、實驗原理 堿變性法基本原理堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性
5、與復性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)留在上清中。四、操作步驟分離質(zhì)粒DNA的方法一般包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。思考題解釋操作過
6、程中第4，5，6，7，11步的作用解釋離心OCLCCC1231pEGFP-N12pEGFP-N1/HindIII3DNAmarker
